Hastalıkların  Teşhisinde  Biyoteknolojik  Yöntemlerin  Kullanılması    

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji 1

01. Genel Bilgiler  
02. Hibridizasyon Yöntemleri  (Genetik Diagnostik Testler) 
   02.01. Southern Blot Hibridizasyonu  
   02.02. Northern Blot Hibridizasyon 
   02.03. Dot Blot Hibridizasyonu 
   02.04. İn Situ Hibridizasyon  
03. İmmunojenik Substansların Saptanması (Moleküler Diagnostik Testler) 
   03.01. İmmun (Western) Blotting 
   03.02. Protein Dot Blot Deneyi 
   03.03. İn Situ Immunperoksidaz Deneyi

01. Genel Bilgiler

Bugün, hekimlik alanında, infeksiyöz hastalıkların tanısında, genellikle, klinik belirtiler, patolojik ve histopatolojik bulgular, etkenlerin izolasyon ve identifikasyonları, etkenlere ait antijenik substansların ortaya konulması, immunolojik yöntemler ile teşhise yardımcı olan diğer testlerden (biyokimyasal, hematolojik, radyolojik, vs) yararlanılmakladır. Bu konvansiyonel tekniklerde bazı hastalıkların teşhisi %100’e varan bir doğrulukta yapılabilmesine karşın, bir çok infeksiyonların tanısı da çok zaman almakta, şüpheli veya negatif sonuçlanmakta, ve bazen de bir teşhis konamamaktadır.

Klinik belirtiler, hastalıkların tanımlanmasında ilk basamağı oluşturmasına karşın, bazı durumlarda, benzer klinik tablo gösteren ve fakat farklı ajanlardan ileri gelen hastalıklarda, subklinik ve perakut infeksiyonlarda, infeksiyonların başlangıç aşamasında, genel belirtilerin bulunduğu olgularda, kronik hastalıklarda, portör ve rezervuarlarda infeksiyonları tanımlayacak ve ortaya koyabilecek spesifik semptomlar bulunmamakta ve hatta, bireylerde bir çok faktörlere bağlı olarak farklı, yetersiz ve hastalığın teşhisine yardımcı olmayan belirtiler ortaya çıkmaktadır.

Otopsi bulguları (makroskopik ve mikroskopik), her zaman spesifik olamamakta ve birçok infeksiyonlarınki ile benzerlik gösterebilmektedir. Ayrıca, her zaman otopsi olanağı da olmamaktadır.

Bakteriyel ve viral ajanlardan ileri gelen bazı infeksiyonlarda da spesifik etkeni her zaman izole ve identifiye etmek mümkün olmamakta, bazı durumlarda etkenin identifikasyonu haftalar sürmektedir. Bir kısım olgularda da primer etken yerine sekonder mikroorganizmalar izole edilmekte ve hastalığın teşhis ve sağaltımı da buna göre düzenlenmekte ve hastaların iyileştirilmesi çok gecikmekte veya mümkün olmamaktadır.

Konvansiyonel immunolojik yöntemlerle bir çok infeksiyonun indirekt teşhisi yapılabilmekte ise de, bir çok olguda yetersiz kalınmakta ve ayrıca kros reaksiyonlar da ortaya çıkmaktadır. Bu klasik yöntemlere son zamanlarda ileri serolojik metotlar, özellikle, immunoassay ler (Radioimmunassay, RIA; Fluorescent immunoassay FIA; Enzyme immunoassay EIA; İmmun peroksidase testleri, vs.) katılarak hastalıkların teşhisinde daha güvenli ve erken sonuçlar alınmaktadır. Ancak, bu testler pahalı olduğu gibi yetişmiş personele ve iyi donatılmış laboratuvarlara gereksinim duyulmaktadır. Bu kadar duyarlı olmalarına karşı, bazı olgularda da yine kros reaksiyonlar ve şüpheli durumlar (yanlış pozitif veya yanlış negatif) ortaya çıkmakta ve tanı gecikmektedir.

İnfeksiyonların erken, kesin ve güvenilir teşhislerinde son 5-10 yıl içinde pratiğe konan biyoteknolojik yöntemler oldukça yararlı olmuş ve konvansiyonel tekniklerin boşluklarını doldurmaya ve gidermeye başlamıştır. Bu metotlar başlıca 2 grup altında toplanabilirler.

Bunlar da:

1) Etkenlerin genetik materyallerinin saptanması (hibridizasyon yöntemleri),  
2) Etkenlerin immunojenik substanslarının (protein, glikoprotein, vs.) saptanması.  

02. Hibridizasyon Yöntemleri  (Genetik Diagnostik Testler)

Hibridizasyon teknikleri, genellikle, materyallerde (doku, organ, hücre kültürü, ekskret, sekret, vs.) bulunan hastalık ajanlarının veya bu dokulara ait hücre DNA’larındaki spesifik genlerin işaretli problarla ortaya konulmasını  amaçlar. Bu nedenle, teknikler “Prob hibridizasyon yöntemleri" olarak da tanımlanmaktadır.

Son yıllarda hibridizasyon tekniklerinde bazı gelişmeler yapıldığından testler daha kolay, çabuk, etkin ve güvenilir hale getirilmişlerdir. Bunlar arasında en fazla kullanılan bazı temel hibridizasyon testlerinin prensipleri aşağıda kısaca bildirilmiştir.  

02.01. Southern Blot Hibridizasyonu

Southern tarafından geliştirildiği için bu adla anılan teknikte, teşhis materyallerinde bulunan mikroorganizmaların izole ve sonra da pürifiye edilmiş DNA’larındaki spesifik sekanslar, işaretli problar (DNA veya RNA prob) yardımı ile ortaya konulur. Bu tekniğin temel aşamaları, kısaca aşağıda gösterilmiştir.

1) Genomik DNA’nın izolasyonu: Patolojik materyallerden mikroorganizmalar (bakteri, virus, parazit vs.) izole edilir, saf olarak üretilir ve bunların DNA’ları ekstre edilerek alınır. Denemelerde, genellikle, saflaştırılmış DNA’lar kullanılır. Mikroorganizmaların DNA’larını elde etmede bir çok yöntemler bulunmaktadır. Araştırıcılar kendi becerilerine ve laboratuvar olanaklarına göre en uygun olanlardan birini tercih ederek kullanırlar. Eğer, bakterilerin DNA’ları kullanılacaksa, önce mikroorganizmaların hücre duvarları ve dış membranları lize edilir. Bunun için lizozim ve diğer enzimlerden yararlanılır. Ayrıca, ekstraksiyon solusyonuna SDS (sodium dodecyl sulphate), proteinaz K ve RNase’larda katılarak, DNA dışındaki bütün komponentler giderilir. DNA’nın endojenik nukleazlardan korunması için EDTA (bu madde Mg iyonlarını bağlayarak bir çok enzimin aktivasyonuna mani olur. Çünkü, Mg bir çok enzimin aktivasyonu için kofaktördür) katılır.

Ökaryotiklerde, ekstraksiyon bufferine fenol veya kloroform da ilave edilerek DNA’nın proteinlerden ayrılması sağlanır. Polisakkaridleri gidermek için de Caesium chloride densite gradient santrifugasyonundan yararlanılır.

DNA’nın konsantrasyonu spektrometrik veya elektroforetik yöntemlerin biri ile belirlenir. Ayrıca saflığı da kontrol edilir.

Eğer, Southern blot hibridizasyon tekniğinde, doku veya organ hücre DNA’ları kullanılacaksa, bunlara ait ekstraksiyon yöntemlerinden uygun olanı seçilerek kullanılır.

Plasmid, faj ve viruslara ait genetik materyalin (DNA) elde edilmesinde ve saflaştırılmasında kendilerine ait saptanan özel yöntemler tercih edilir.

2) Spesifik RE ile dijestiyon: Hedef DNA saf olarak elde edildikten sonra, çok az miktarda (0.5 - 5 µg, bu miktar kullanılan hedef DNA’nın türüne göre değişebilir) alınarak ependorf tüpüne konur. Bunun üzerine, dijestiyonda kullanılacak restriksiyon endonukleaz enziminden, tam bir dijestiyon sağlayabilecek miktarda ilave edilir ve uygun bir süre etkilenmesi sağlanır. Böyle enzimler arasında, EcoRl, Hind III, BamHI, vs. bulunmaktadır. Eğer gerekirse denemede plana uygun olarak iki veya daha fazla enzim de kullanılabilir (restriksiyon analizlerinde).

DNA suspansiyonu ile enzimler uygun ısıda (genellikle, 37°C’de 4-6 saat kadar) inkubasyona bırakılır. Bu süre içinde enzim, DNA’yı belli bazlardan keserek, küçüklü-büyüklü çok sayıda DNA segmentleri (fragment) meydana getirir.

3) Fragmentlerin elektroforezisi: Dijeste DNA solusyonunu agarose jele (PAGE' de olabilir) uygulanarak uygun bir süre, bazen bir gece 40-50 volt altında elektroforeze tabi tutulur. Bu separasyon sırasında fragmentler büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar oluştururlar. Büyükler başlangıç yerinde, küçük segmentler de karşı uçta lokalize olurlar. Kullanılan cereyanın şiddeti, jelin kalınlığına göre ayarlanır.

Bu aşamada jel üzerinde oluşan bantlar ethidium bromide ile boyanarak U V-ışınları altında görüntülenebilir ve bantlar, standart bantla karşılaştırılarak değerlendirilirler. Eğer başlangıçta iyi bir dijestiyon (kesim) yapılmışsa 20 kb dan büyük 100’e yakın bant meydana gelebilir.

DNA’lardaki farklılıkları ortaya koymada, restriksiyon analizleri yapmada, RFLP veya RAPD gibi tekniklerde agarose jel yanı sıra PAGE (poliakrilamid jel elektroforezis) de kullanılabilir.

4) Bantların membran üzerine transferi (Southern transfer): Agarose jel (veya PAGE)  üzerinde bulunan bantların naylon veya nitroselüloz membran üzerine transferleri yapılır. Bu işlem, elektro transfer, alkali kapillarite veya diğer geliştirilmiş yöntemlerin biriyle kolayca yapılabilir. Nitroselüloz membran yerine, yakın zamanlarda naylon membranlar daha fazla tercih edilmektedirler. Bunun başlıca nedenleri arasında, naylonlar daha sağlam, birim alanda daha fazla DNA adsorbsiyonu sağlamakta, DNA’nın fikzasyonu daha kuvvetli olmakta ve bir membran iyice yıkanıp temizlendikten sonra tekrar kullanılabilmesi olanağı bulunmaktadır. Aynı zamanda, pozitif yüklü olanlar alkaline transferine ve DNA’nın fikzasyonuna da çok uygundurlar ve yüksek sensitivite de sağlarlar. Elektro transfer tekniği ile, DNA aktarım işlemininin süresi bir geceden, 1-3 saate kadar indirebilir.

5) Denatürasyon ve fikzasyon: Naylon üzerine transfer edilen DNA bantları kurutulur ve 0.5 N NaOH ile muamele edilerek denatüre edilir (çift iplikçik DNA, bazlar arası bağlar koparak tek iplikçik hale gelir). Bu aşamadan sonra naylon membran, 80°C’ye kadar ısıtılarak, tek iplikçiklerin membran üzerine fikze edilmesi sağlanır. Fikzasyonu sağlamlaştırmak için tespit işlemi vakum içinde yapılır.

Son zamanlarda gerek denatürasyon ve gerekse fikzasyonda daha değişik metotlar da kullanılmakladır.

6) Hibridizasyon: Naylon membran önce, pre hibridizasyon solusyonu içinde 60-65°C’de 2-4 saat kadar bulundurulduktan sonra yıkanır. Eğer bu ön muamele yapılmazsa, problar tüm membran üzerine bağlanarak filmin tüm siyah görünmesine neden olur. Bu aşamadan sonra, membran üzerine işaretli DNA prob (veya RNA prob) ilave edilir. Problar 32P (veya biotinle) işaretli olabilir. Membran üzerine konulan tek iplikçik ve işaretli prob, kendine komplementer olan tek iplikçik hedef DNA segmenti ile non kovalent bağlarla karşılıklı olarak birleşir ve çift iplikçik DNA x DNA dubleksi (eğer RNA prob kullanılırsa DNA x RNA dubleksi) oluşur (hibridizasyon). Bu işlem bir gece kadar sürdükten sonra, membran yıkanarak, birleşmemiş olan tek iplikçik hedef DNA sekansları ve bağlanmamış olan tek iplikçik problar giderilir ve böylece membran üzerinde sadece çift iplikçik sekanslar kalmış olur.

7) Otoradyografi: Naylon membran üzerine, X-ışınlarına duyarlı bir film (Kodak XAR-2) kapatılarak -70°C’de bir gece tutulur ve radyoaktivitenin film üzerine etkilemesi sağlanır.

Bu sürenin sonunda film banyo edilir. Bu film üzerinde, işaretli problarla birleşmiş hedef DNA sekanslarının bulunduğu bölgeler siyah renkte görülürler. Bu bölgeler, aranılan etkene ait spesifik genin lokalize olduğu yerleri ifade eder. Böylece, aranılan hedef gen bulunur ve teşhis konulur.

Eğer Probları işaretlemede biotin kullanılmışsa, avidin, peroksidaz ve kromojen madde yardımı ile oluşan renk değişikliği, aranılan hedef DNA segmentinin bulunduğu yerleri gösterir.

Yukarıda aşamaları anlatılan Southern blotting tekniğinde  de  yine iyi yetişmiş teknik elemana,çok fazla ve duyarlı malzemeye ihtiyaç duyulduğu gibi, en önemlisi spesifik etkenin izolasyonuna ve saf olarak üretilmesine gerek vardır.Bu da zaman alan ve klasik yöntemlerle gerçekleştirilen önemli bir ön aşamadır. Ayrıca, kros reaksiyonları önlemek için, probların çok spesifik olmaları da önemlidir. 

02.02. Northern Blot Hibridizasyon

Bu teknik genelde, Southern blotting yöntemine benzer. Ancak, DNA yerine mRNA, viral RNA veya total RNA kullanılır. Buna göre, RNA’nın agarose jel üzerinde separasyonu, filtreye transferi, spesifik probla (RNA veya DNA) hibridizasyonu ve otoradyografisi, Northern Blot Hibridizasyonu olarak  adlandırılır. Bu teknik, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken analizlerini yapmada, doku veya organlardaki mRNA seviyesini belirlemede ve viral RNA’lar arasındaki farkı saptamada yarar sağlar.

Southern blottinge benzeyen bu teknikte RNA’ların restriksiyon enzimleri ile kesimi işlemi yoktur. Bu nedenle de yöntemde önemli bir ekonomi ve zaman tasarrufu sağlanmaktadır.

Northern blot hibridizasyonunun başlıca aşamaları aşağıda verilmiştir.

1) RNA’nın izolasyonu (total sellüler RNA, mRNA, viral RNA, vs.)  
2) RNA’nın elektroforezde separasyonu  
3) RNA’ların naylon membrana transferi (Northern transfer)  
4) İşaretli DNA veya RNA problarla hibridizasyon  
5) Otoradiografı ile görüntüleme

Gerek total sellüler RNA’yı ve gerekse diğerlerini (mRNA, viral RNA) izole etmede ve saflaştırmada bir çok laboratuvar yöntemleri geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Hepsinde de önemli olan nokta, RNA’ların DNA ile kontaminasyonunu önlemek ve bunun için de gerekli tedbirleri almaktır. RNA’lar, DNA’dan selektif olarak lithium chloride veya sodium acetate ile presipitasyon yöntemiyle çöktürülerek ayrılabilirler. İzolasyon, muhafaza ve diğer işlemler sırasında, RNA’ların RNase ile kontaminasyonuna azami dikkat edilmelidir. RNase ısıya dayanıklı olduğundan ve kofaktöre de ihtiyaç göstermediğinden, aktivitesi kolaylıkla giderilemez. Bu nedenle özel tedbirlerin alınmasına gerek vardır.

Ekstre edilen RNA’nın saflığı ve konsantrasyonu iyice belirlenmelidir.

RNA moleküllerini agarose jelde separasyonundan önce restriksiyon enzimi ile kesime gerek yoktur. Jele de herhangi bir denatüran madde konulmayabilir. Ancak, tek iplikçik RNA molekülünün sekonder yapısı (kendi üzerine katlanması) jeldeki hareketini kısıtlayabilir. Bunu önlemek için agarose jele denatüranlardan birinin (formaldehid veya glyoxal) katılması gerekir. Ancak, daha avantajlı olması nedeniyle, genellikle, formaldehid tercih edilmektedir.

Northern blotting tekniğinin diğer işlemleri, aynen, Southern blotting de olduğu gibi yürütülür ve değerlendirilir.

Eğer istenirse, mRNA veya viral RNA, reverse transkriptase enzimi yardımı ile komplementer DNA (cDNA)’ya çevrilerek Southern blot tekniği uygulanabilir.

Bu teknik de, aynen Southern blotting de olduğu gibi zaman alıcı ve bir çok ön işleme ve teknik aşamalara ihtiyaç duyulmaktadır.  

02.03. Dot Blot Hibridizasyonu

Bu yöntemde, genomik DNA segmentleri hibridizasyondan önce elektroforetik bir separasyona tabi tutulmaz. Patolojik materyallerden mikrobial nukleik asit ekstre edilerek çıkarılır ve konsantre edilirler. Gerekirse birden fazla klinik materyal kullanılır ve bunların nukleik asitleri de ayrı ayrı ekstre ve konsantre edilir. Bu aşamadan sonra örnekler iki veya 5 katlı olarak dilue edilir. Her örneğe ait dilusyonlardan naylon veya nitroselüloz membran üzerine birer damla damlatılır. Burada denatürasyona tabi tutularak membran üzerine fikse edilirler. Üzerlerine 32P ile işaretli spesifik tek iplikçik problar ilave edilir. Bu aşamadan sonraki işlemlere aynen Southern blotting de olduğu gibi devam edilir.

Film üzerinde oluşan koyu lekeler hibridizasyon bölgelerini ve dolayısıyla de aranan DNA sekanslarını veya mikroorganizmalara ait spesifik bazları gösterir.

Eğer problar biotinle işaretlenmişse, reaksiyon, renklerin görünümüne göre değerlendirilir.

Bu yöntem biraz daha basitleştirilmiş olmasına karşın yinede bir çok ve spesifik aşamaları bulunmaktadır. Ayrıca, diğer iki teknikte de olduğu gibi, bunda da en önemli nokta, izole edilen ve DNA'sı ekstre edilen etkenlerin primer etken olmalarıdır.  

02.04. İn Situ Hibridizasyon

Bu teste infekte doku kültürleri, biyopsi materyalleri, doku süspansiyonları, periferal kan vs. den bir damla lam üzerine konur. Denatürasyondan sonra işaretli (32P, biotin-avidin, vs.) cDNA prob ilave edilerek hibridizasyon sağlanır. Mikroorganizmaların DNA’larının bulunduğu yerler kolayca belirlenir.

Test doku kesitleri ile de yapılabilir. Örn., infekte akciğer dokusu nötral formalinli buffer içinde fikse edilir, parafinlenir ve ince kesitler (5 mikrometre kalınlık) yapılır. Kesitler parafinleri giderildikten  ve dehidre edildikten sonra temiz bir lam üzerine yerleştirilirler ve üzerine biotinle işaretli cDNA prob konur ve her ikisi birden denatürasyona tabi tutulur (90°C’de 5 dakika). Karışım 37°C’de 18-24 saat tutularak hibridizasyon sağlanır. Sonra ortama avidin-biotin peroksidaz kompleksi katılır ve renk değişimi olan bölgeler aranan mikroorganizma DNA segmentlerinin bulunduğu yerlerdir.

03. İmmunojenik Substansların Saptanması (Moleküler Diagnostik Testler)

Hastalık ajanlarının ve özellikle, bunlardan elde edilen antijenik substansların (protein, glikoprotein, vs.) ortaya konmasında biyoteknolojik yöntemlerden büyük ölçüde yararlanılmaktadır. Bunlardan bazılarının prensipleri ve adları aşağıda belirtilmiştir.  

03.01. İmmuno (Western) Blotting

Bu teknik, mikroorganizmaların yapılarında bulunan antijenik proteinlerin saptanmasında kullanılmaktadır. Virusların veya bakterilerin proteinleri saf olarak elde edildikten ve SDS ile muamele edildikten sonra SDS-poliakrilamid jel elektroforeziste molekül ağırlıklarına göre bir separasyona tabi tutulurlar. Bu işlemlerden sonra, elektro transferle nitroselüloz kağıtlarına aktarılır. Havada kurutulur (gerekirse -20°C’de muhafaza edilir). Kağıt şeritler, poliklonal veya monoklonal antikorlarla muamele edilerek, antikorların proteinlerle (antijenle) birleşmesi sağlanır. Kağıt şeritler yıkandıktan sonra, üzerlerine, birinci antikorlara karşı hazırlanmış ve işaretlenmiş  (32P, biotin vs.) keçi anti İgG spesifik antikorları konur .

Eğer testte 32p ile işaretli antikorlar kullanılmışsa sonuç otoradiografik yönteme göre veya biotinli antikor kullanılmış ise avidin-peroksidaz konjugatı, 4-chloro-1-naphtol substratlı ilave edilerek renk değişikliğine göre değerlendirme yapılır.

Test aynı zamanda antikorların saptanmasında da kullanılır.  

03.02. Protein Dot Blot Deneyi

Bu denemede teşhisi istenen hedef mikroorganizmaya karşı hazırlanmış olan spesifik monoklonal antikorlar nitroselüloz kağıtlarına konur ve 10-15 dakika kurutulur (gerekirse jelatinde bloklanır). İnfekte dokulardan hazırlanan mikroorganizmalara ait süspansiyonların (protein antijen) supernatantları, filtre kağıdında kurutulmuş olan antikorların üzerine damlatılır ve 2 saat kadar etkileşimi sağlanır (antikor-antijen konjugatı). Filtre yıkandıktan sonra infeksiyöz ajana karşı hazırlanmış ve biotinle işaretlenmiş antiserum, kağıttaki konjugat üzerine damlatılır ve 2 saat inkube edilir ve yıkanır. Sonra, reaksiyonu oluşturmak için avidin enzim konjugatı ve substratı ilave edilir. Renk durumuna göre sonuç değerlendirilir.

03.03. İn Situ Immunperoksidaz Deneyi

Bu testte, formalinle fikse edilmiş infekte doku kesitlerinde poliklonal veya monoklonal antikorlar kullanılarak. bakteriyel veya viral proteinler saptanır. Kesitler, Spesifik antikorlarla inkube edildikten sonra da substrat olarak amino ethyl-carbazole katılır. Dokularda bulunan mikrobial proteinler renk değişikliğine göre saptanırlar.