DNA   Baz   Sıralarının   Saptanması 

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji 1

01. Genel Bilgiler  
02. Maxam-Gilbert Yöntemi (Kimyasal Metod)  
03. Sanger Yöntemi (Enzimik Metod)

01. Genel Bilgiler

Prokaryotik organizmaların (bakteri), faj, virus ve plasmidlerin DNA'larında bulunan nukleotid sekanslarının belirlenmesinde başlıca iki klasik yöntem önderlik etmiştir. Bunlardan biri, Frederick Sanger (1975) tarafından geliştirilen ve dideoksinukleotid olarak adlandırılan tekniktir (enzimik metod). Bu metotla, Sanger, küçük DNA fajlarından olan øX174 fajının 5386 baz çiftinden (bp) oluşan genomunun nukleotid sıralarını saptamıştır (sequencing).

Baz sıralarını saptamada diğer bir metod da A.M.Maxam ve W.Gilbert'e (1977) aittir (kimyasal metod). Bu araştırıcılar da SV40 virusunun baz sekanslarını belirlemişlerdir (5226 bp). Greg Sutcliffe (1979), Gilbert'in laboratuvarında aynı tekniği uygulayarak pBR322 plasmidinin baz sıralarını tespit etmiştir (4362 bp).

Artık, bu gün, DNA baz sıralarının saptanması, geliştirilen yeni aletler yardımıyla otomatik olarak kolay, doğru ve kısa bir süre için de (bir günde binlerce baz) yapılabilmektedir (automatic DNA sequencing).

Aşağıdaki bu iki temel yöntemin genel prensipleri hakkında çok kısa bilgi verilmektedir. Ancak, bu iki metotta da sonraları yapılan bazı değişikliklerle  yenilikler kazandırılmıştır. Pratikte en fazla enzimik yöntem kullanılmamaktadır.  

02. Maxam-Gilbert Yöntemi (Kimyasal Metod)

Aşağıda, kısa bir DNA segmentinin baz sıralarının saptanması örnek olarak verilecektir.

1) Baz sıraları saptanması istenen DNA, spesifik restriksiyon endonukleaz (Örn., EcoRI) ile kesilerek değişik boylarda çift iplikçikli DNA fragmentleri elde edilir.

2) Bu DNA segmentleri, 3'-uçlarından radyoaktif bir madde olan 32P ile işaretlenirler.  
3) Radyoktif fosforla işaretli olan bu çift iplikçikler çeşitli yöntemlerle (ısı, NaOH, vs.) denatüre edilerek tek iplikçikli hale getirilirler.  
4) Bu denatüre süspansiyon, 4 eşit kısma ayrılarak tüplere taksim edilirler.  
5) Tüplerin her birine, çok kontrollü miktar ve süre de spesifik bazları parçalayan bazı kimyasal maddeler (dimetil sulfat, hidrazin, formik asit, piperidin, vs.) katılarak etkilemeleri sağlanır. Bu maddeler, bir DNA segmentinde sadece bir tür baza etkileyecek tarzda ayarlanmışlardır. Şöyle ki,

a) Birinci tüpteki işaretli ve tek iplikçik DNA fragment süspansiyonuna guaninine (G) etkileyen dimetil sülfat (DMS) katıldığını düşünelim. Bu madde bir segmentte bulunan guaninlerden birine etkileyecek diğerleri ise sağlam kalacaktır.  
b) İkinci tüpe hem guanin ve hem de adenine (A) etkileyen kimyasal maddeler katılır ve reaksiyonunun sağlanması beklenir. Reaksiyonunun sonunda DNA segmentlerindeki hem guanin ve hem de adenin bazları parçalanır.  
c) Üçüncü tüpe sadece timine (T) etkileyen madde katılır. Bu baz parçalanır.  
d) Dördüncü tüpe ise hem timin ve hem de sitozine (C) etkileyen maddeler katılarak reaksiyona bırakılır. Bu tüpte timin ile sitozin bazları parçalanır.  

6) Bu 4 tüpte reaksiyonların sonunda çok değişik boylarda DNA segmentleri meydana gelecektir. Ancak, bunların içinde uçları 32P ile işaretlenmiş olanlar önemlidir.

a) Birinci tüpte değişik boyda ve sadece G-bazlarından kesilmiş segmentler bulunacaktır,  
b) İkinci tüpte, hem DE G ve hem de A bazlarından kesilmiş fragmentler vardır.
c)Üçüncü tüpte,sadece T-bazlarından kesilmiş fragmentler bulunur.  
d) Dördüncü tüpte de, hem T- ve hem C bazlarından kesilmiş DNA segmentleri vardır.

7) Bu tüpler ayrı ayrı agarose gel elektroforezise (veya poliakrilamid gel elektroforezis, PAGE) tabi tutularak, elektriksel ortamda, boylarına göre (molekül ağırlıklarına göre) büyükten küçüğe doğru bir seperasyona tabi tutulurlar. Jel üzerinde, büyük segmentler baş tarafta ve küçük segmentler de karşı uç da yer alacaklardır.

8) Bu jel üzerine, X-ışınlarına duyarlı bir film yerleştirilerek, radyoaktivitenin (32P) filme etkilenmesi sağlanır. Filmlerin geliştirilmesi sonunda, radyoaktif fosforun etkilediği yerler siyah lekeler (bantlar) halinde ortaya çıkarlar (otoradyografi).

9) Dört tüp için elde edilen bantlar birbirleriyle karşılaştırılır ve değerlendirilmesi yapılır. Bu değerlendirme tüplere göre aşağıda gösterilmiştir.

a) 1.tüpe ait sütunda, 3 tane G bandı,  
b) 2. tüpe ait sütunda, 3 tana G bandı ve 3 tane de A bandı (toplam 6 bant),  
c) 3. tüpe ait sütunda, 2 tane T bantı,  
d) 4. tüpe ait sütunda, 2 tane T bantı ve 2 tane de C bandı bulunacaktır (toplam 4 bant).

Yukarıda belirtildiği tarzda, incelenmeye alınan DNA segmentinin baz sıraları, yukarıdan aşağı veya aşağıdan yukarı doğru bantlar birbirleriyle karşılaştırılarak, şekilde belirtildiği gibi, saptanır.  

03. Sanger Yöntemi (Enzimik Metod)

Sanger metodunun esasını spesifik zincir terminatörleri olan 4 tür 2,-3-dideoksinukleotidlerin (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) çok kontrollü miktarlarda ve sürelerde kullanılması oluşturmaktadır. Bu maddelerin yapılarında bulunan, deoksiribozlarda 2. ve 3. pozisyonlardaki OH moleküllerindeki oksijenlerin olmaması, sadece H'nin bulunması, sentez sırasında, bu maddelerin sıraya girmesi durumunda, polimerizasyonu durdurmaktadır. Çünkü, bunlar yandaki moleküllerle fosfodiester bağları kuramamaktadırlar.

Bu yöntemde, test ortamında, 4 tür ddNTP, DNA polimeraz I (klenow  fragmenti), 4 tür DNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP: bu nukleotidler polimerizasyon için gereklidirler) yanı sıra, ayrıca, baz sırası tayini yapılacak olan kısa tek iplikçik DNA segmenti (kalıp sekans) ve bunun 3'-ucundaki DNA bazlarına komplementer olan ve 32P ile 5'-uçlarından işaretlenmiş çok kısa (4 bazlık) primer DNA segmentleri de bulundurulur. Bu primer DNA fragmentlerı, polimeraz I enziminin sentezi için basamak oluştururlar.

Bu teknikle baz sıralarının tayini kısaca aşağıda açıklanmıştır.

1) Baz sırası saptanacak olan DNA, spesifik restriksiyon endonukleazlardan biri ile (Örn., EcoRI gibi) kesilerek değişik boylarda DNA segmentleri elde edilir.

2) Bu segmentler ısı (veya 0.5 N NaOH) ile denatüre edilerek tek iplikcikli hale getirilirler.

3) Denatüre edilen segmentler 4 eşit kısma ayrılarak tüplere taksim edilirler.

4) Kısa DNA primerleri (5'-uçlarından 32P ile işaretlenmiş) test ortamına ilave edilir. Bu primerler, baz sırası tayini yapılacak olan DNA segmentlerinin 3'-uçlarındaki 4 bazın komplementeri olduklarından bunlarla çok çabuk birleşirler.

5) Tüplerin her birine, primerlerin yanı sıra, yeterli miktarda ve polimerizasyonda  kullanılacak olan 4 tür (normal) deoksinukleotid trifosfat, polimeraz I enzimi (klenow fragmenti) ile her tüpe ayrı tür ddNTP konur.

Primer DNA segmentleri, tayini yapılacak DNA segmentinin 3'-ucundaki 4 nukleotide bağlanınca, polimeraz I enzimi, ortamdaki deoksinukleotid trifosfatları (DNA segmentini kalıp olarak kullanarak) primerlerin 3' -OH ucuna yerleştirerek zincirin büyümesini sağlar. Ancak, sıraya ortamdaki spesifik dideoksinukleotid trifosfatların girmesi halinde sentez durur ve sonlanır.

1. tüpte: Bu tüpe ddGTP konulmuş olsun: Tüpte polimerizasyon sırasında, baz sırası belirlenecek olan hedef DNA segmentinde sitozinin (C) sırada bulunduğu durumda, polimerase enzimi bunun karşısına guanini (G) getirerek primerin 3'-OH ucuna ilave etmesi gerekecektir. Ortamda, normal guanosin trifosfatlar (dGTP) yanı sıra, dideoksinukleotid guanosin trifosfatlar (ddGTP) da bulunmaktadır. Eğer, polimerase enzimi ddGTP'ı, normal dGTP yerine, sıraya koyarsa, sentez bu aşamadan sonra daha ileri gidemez ve sonlanır.

2. tüpte: Bu tüpe ddATP konulmuş olsun: Bu durumda, polimerizasyon sırasında, enzim, DNA segmentinde Timinin (T) sırada olduğu durumda, primerin 3'-OH ucuna Adenini (A) ilave etmesi gerekir. Eğer enzim, ddATP'ı primerin ucuna katarsa, buradan itibaren sentez durur.

3. tüpte: Bu tüpe ddCTP konulduğunda, bu madde sentez sırasında DNA'daki adenin karşısında sıraya girerek sentezi durdurur.

4. tüpte: Bu tüpe de ddTTP konulduğundan, sentez sırasında DNA'daki adenin karşısında bu ddTTP gireceğinden sentez sona erecek ve değişik boylarda segmentler oluşacaktır.

Bundan sonra, 4 tüp ayrı ayrı agarose gel elektroforeze tabi tutularak segmentler boylarına göre, bir seperasyona tabi tutulurlar. Sonra bunlar otoradyografi ile belirgin siyah bantlar haline getirilir ve aynen Maxam-Gilbert yönteminde olduğu gibi karşılaştırılarak baz sıraları saptanmaya çalışılır.

Baz sıralarının saptanması şeklinde izah edildiği tarzda yapılır.

Son yıllarda geliştirilen yeni tekniklerle (automated DNA sequencer) otomatik olarak DNA baz sıraları tayini (sequencing) yapılabilmektedir.