Günümüzde, mikrobiyoloji alanında doğal boyalar (karmin, orsein, indigo, kınakına, v.s) çok az kullanılmasına karşın, sentetik boyalardan çok daha fazla yararlanılmaktadır. İlk sentetik boya, anilinden elde edildiği için bütün sentetik boyalara anilin boyaları adı verilmiştir. Ancak, bunların çoğu anilinden elde edilmediği gibi, anilinle de ilişkili değildirler. Boyalar, genellikle, katran distilasyon ürünü olup benzen derivatlarıdırlar. Benzen halkasında bulunan hidrojen atomları yerine bazı element veya radikallerin girmesiyle çeşitli birleşikler meydana gelir. Örn, bir hidrojen atomu yerine hidroksil (OH) grubu girerse fenol (karbolik asit) oluşur. Diğer hidrojen atomu yerine de metil grubu girerse kresol teşekkül eder. Hidrojen atomlarının yerine metil grubun girmesine göre orto-meta ve para kresol meydana gelir.

İyonize oldukları zaman, molekülün porsiyonu negatif elektrikle yüklenir. Bunlar da renkli asitlerin tuzlarıdır (genellikle, sodyum tuzu). Bazen potasyum, kalsiyum veya amonyum tuzları olabilir. Asit boyalar arasında, asit fuchsin, safranin, asit pikrik, eosin, v.s bulunmaktadır.

İyonize oldukları zaman, molekülün boya kısmı pozitif elektrikle yüklenir. Bunlar da renkli bazların tuzlarıdır (genellikle, klorid benzen sulfat, okzalat ve asetat). Bazik boyalardan, metilen mavisi, Jansiyana violet, bazik fuchsin çok kullanılır.

Asit ve baz boyaların uygun oranda karışımlarından elde edilir (Giemsa, Wright, Leishman vs).

Boyalar içerdikleri kromoforik gruplara göre sınıflara ayırırlar. Bunların başlıcaları şöyledir,

Azo boyaları başlıca iki kısma ayrılırlar.

2- Diazo ve poliazo boyaları: Molekülde birden fazla azo grubunun bulunması sonu bu tür boyalar meydana gelirler (azo mavisi, biebrich scarlat, bismark braun-Y, brillant purpurin-R, klorazol siyahı-E, kongo kırmızısı, evans mavisi, sudan siyahı -B, sudan kırmızısı -7B, tripan mavisi, vital kırmızısı)

Antrakinon boyaları, anthracen'in oksidasyonu sonu oluşurlar ve anthracen derivatlarıdır (alizarin kırmızısı-S, purpurin)

Bu grup boyalarda thiazol halkası vardır ve indamine grubu da kromofordur (geranin-G, primulin, titan sarısı-G, thioflavin-S).

1. İndamin boyaları: İndamin'in metile olmuş aminoderivatları olup biyolojik öneme sahip değildirler.
2. İndofenol boyaları: İndofenoller, indaminlere yakın özelliktedirler (indofenol, indofenol mavisi).
3. Tiazin boyaları: Tiazin boyaları, sülfür atomuna veya nitrogenlerin biri ile birleşmiş fenil ve quinanoid halkasına sahiptirler (azur -A, azur -B, metilen azur, meliten mavisi, metilen yeşili, metilen violet, thionin, toluidin mavisi-O).
4. Oksazin boyaları: Bu boyalarda, tihazin'in sülfürü, oksijen atomu ile yer değiştirmiştir (birillant-kresil mavisi, kresil violet asetat, gallocyanin, new bleu -R, nil blue sulfat, resazurin).
5. Azin boyaları: Bunlar fenazin derivatları olup 2 tane benzen veya bir benzen ve bir quinonid halkasına sahiptirler. Aminoazinler (neutral red, neutral violet), safrainler (emethyst violet, azokarmin - G, fenosafranin, safranin -O), indulinler (nigrosin).

1. Diamino trifenil metan boyaları: Kuvvetli bazik karakterde boyalardır (brillant yeşili, fast green FCF, light green-SF).
2. Triamino trifenil metan boyaları: Bu boyalar da kuvvetilce bazik ve bazıları da asit karakterdedir (asit fuchsin, anilin mavisi, bazik füchsin, kristal violet, etil green, etil violet, hofmann violet, metil mavisi).
3. Hidroksi trifenil metan boyaları: Bu boyalar genellikle asit karakterde olup indikatör olarak kullanılır (resolik asit)
4. Difenil - naftil metan boyaları: Bunlar difenil metan boyalarının naftil derivatlarıdır (victoria mavisi -B, victoria mavisi -R, night blue, woolgreen-S).

Bu boyalar xanthene derivatları olup bir kısmı asit ve bir kısmı da bazik karakterdedirler. Genellikle indikatör olarak kullanılır. Bu grupta:

1. Pironin boyaları: Bunlar xanthene'nin metile olmuş diamino derivatlarıdır (pyonine -B, pyronine -Y).
2. Rodamin boyaları: Pyroninlere benzeyen bu boyalar 2 amino grup ihtiva etmeleri nedeniyle baziktirler (fast asit blue-R, rhodamine-B).
3. Fluoran boyaları: Bunlar fluorane derivatlarıdır (eosin -B, eosin -Y, etil eosin, eritrosine (mavimsi), eritrosine (sarımsı), fluorescein, merchurochrom 220, phloxine -B, rose bengal).
4. Fenolftalein ve sulfoneftalein boyaları: Bu grupta: bromoklorfenol mavisi, bromokresol yeşili, bromokreosol purpul, boromo fenolmavisi, bromo fenol kırmızısı, bromotimol mavisi, klorokresol yeşili, klorofenol kırmızısı, kresolftalein, kresol kırmızısı, meta kresol purpul, fenolftalein, fenol red, timol mavisi bulunur.

Doğal boyalar bakteriyolojinin ilk zamanlarında fazla kullanılırdı. Bu gün yerini sentetik boyalara bırakmıştır. Ancak, birkaç tanesi hala kullanılmaktadır. Başlıcaları:

1. İndigo: İndigofera cinsi bitki türleri, indican, denen glukozid ihtiva ederler. Bunun fermentasyonu sonu indigo oluşur.
2. İndigo - karmin: Bu boya indigo desulfonik asitin sodium tuzudur. Asit karakterli olup mavi renklidir.
3. Cochineal: Dişi insekt Coccus cacti'nin ezilmiş ve kurutulmuş tozudur.
4. Karmin: Cochineal'ien alum veya diğer metal tuzları ile muamelesinden elde edilir. Nukleus boyası olarak önemlidir.
5. Orcein: Lecanora tinctoria ve Rocella tinctoria türü likenlerden elde edilir. Bunlar renksiz ve kristal fenolik bileşikler ihtiva ederler. Bunlardan biri orcinol olup orceine çevrilir. Bu, violet - renkli bileşiktir ve hafif asittir.
6. Litmus: Bu madde, ayni orcein gibi, bazı likenlerin soda veya kireç kaymağı ile ve sonradan da ammonia ve hava ile muamelesi sonunda elde edilir. Litmus'un esas maddesi azolitmin'dir.
7.Brazilin: Bu madde brazil ağacı kabuğu ekstraktından elde edilir. İlk elde edildiğinde renksiz ve sonra da okside olunca kırmızı renk alır.
8. Hematoxylin: Güney Amerika 'da yetişen legume türü bitkiden elde edilir. Ağacın, su ile ekstraksiyonu sonucu meydana gelir ve hava ile temasta hemateine dönüşür.

Boyamayı izah için genellikle, fiziksel ve kimyasal temele dayalı görüşler ileri sürülmüştür. Ancak bu günkü bilgilere göre, boyama, ne tam fiziksel ne de tam kimyasal bir karaktere sahiptir. Bunların her ikisinin de kombinasyonudur.

Fiziksel görüş: Bu teoriye göre, boyanma reaksiyonu, kapillarite, ozmosis, adsorbsiyon ve absorbsiyon olaylarına dayanır. Boya ile madde arasında bir bileşik gelişmeden meydana gelen reaksiyon, bu görüşün esasını oluşturur. Bu nedenle, bakteri, solventler içine bırakılırsa veya bunlarla muamele edilirse boya tekrar ekstre edilebilir.

Kimyasal görüş: Hücre içinde bulunan asit ve bazik karakterdeki yapıların, bazik veya asit boyalarla birleşme yetenekleri bulunmaktadır. Böylece boyanma, asit ve bazik sükrüktürlerle oluşan karşılıklı kimyasal ilişkilere dayanmaktadır.

Mikroorganizmaları iyi görebilmek ve ayrıntılarını tetkik edebilmek için bir çok genel ve özel boyama yöntemleri ortaya konulmuştur. gerektiğinde, bunlardan en uygunu seçilerek kullanılır.

Mikrobiyolojide kullanılan boyama yöntemlerini başlıca 2 gruba ayırmak mümkündür.

2. Bileşik boyamalar: Birden fazla boyanın iştiraki ile yapılan boyama yöntemleridir. Bunlar arasında:

a) Diferensiyel boyamalar: Mikroorganizmaları birbirinden ayırmada kullanılır (Gram, Ziehl-Neelsen).
b) Sütrüktürel boyamalar: Bakterilerin iç ve dış yapıları hakkında bilgi edinmek için kullanılan bileşik boyama yöntemleridir (spor, kapsül, flagella, çekirdek, lipid, v.s.).

Hazırlanan preparat üzerine boya solusyonundan (kristal violet) konarak 20-30 saniye kadar bekletilir. Sürenin sonunda boya dökülür, preparat su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir. Mikroorganizmalar mor renkte görülürler.

Bu amaçla Löffler metilen mavisi solusyonu kullanılır. Preparat üzerine boya solusyonu konarak 5-8 dakika bekletilir. Boya dökülür, yıkanır, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir. Mikroplar mavi renkte görülürler.

Gram tekniği, mikrobiyolojide çok kullanılan bir boyama yöntemi olup mikroorganizmaların klasifikasyonunda ve identifikasyonunda da yararlanılır. Bu gün uygulanan teknik, ilk kullanılan Gram (1884) boyasından biraz değişik şekildedir. Fakat hepsinde de esas aynı kalmaktadır. Laboratuvarda en fazla uygulanan Gram boyama yöntemi şöyledir:

a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir
b) Kristal violet (veya metil violet) solusyonu ile 2-3 dakika boyanır.
c) Boya dökülür ve preparat üzerine lugol solusyonu konarak 1-2 dakika beklenir. Lugol solusyonu dökülür.
d) Absolut alkolde dekolere edilir (alkol renksiz akıncaya dek).
e) Su ile yıkanır.
f) Safranin (veya eosin, sulu fuchsin) ile 5-10 saniye boyanır.
g) Su ile yıkanarak boya giderilir.
h) Kurutma kağıdında (veya havada) kurutulur.
i) Sedir yağı konarak immersiyon objektifi ile muayene edilir.Bu yöntemle mor görülen mikroorganizmalar Gram pozitif ve pembe görülenler de Gram negatif olarak değerlendirilirler. Genç kültürlerde bulunan mikroplar, genellikle, kuvvetli Gram pozitif görülmelerine rağmen, eski kültürlerde Gram negatifliğe doğru bir eğilim vardır.

1. Gram pozitif mikroorganizmalar, negatiflerden daha düşük pH limitlerine sahiptirler. Bu nedenle de bazik boyalara karşı affiniteleri fazladır.
a) Asit boya ile Gram pozitif görülen mikroplar, boyanın alkalinitesi artırılırsa Gram negatif olabilirler.
b) Bazik boya ile Gram pozitif görülen mikroplar, boyanın asiditesi artırılırsa Gram negatif olabilirler.
2. Gram pozitiflerden elde edilen lipoidal maddelerin özelliği, Gram negatiflerinkinden farklıdır. Birincide sature olmamış yağ asitleri daha fazladır ve ayni zamanda oksidan maddelere olan ilişkisi de yüksektir. Kullanılan mordanların oksidan olması, bazik boyalara karşı affiniteyi artırır.
3. Gram pozitif mikropların hücre duvarı pepitidoglikan yapısında olup miktarca çok fazladır. Bu strüktür Gram negatiflerde ise çok azdır. Bu tabakanın giderilmesi, Gram pozitif mikropları, Gram negatif hale sokar. Gram pozitiflerde ayni zamanda Magnesium ribonukleate'da fazla bulunur. Bu madde negatiflerde yoktur.
4. Alkolle dekolorasyonun gereğinden fazla yapılması Gram negatifliğe eğilimi artırır.
5. Gram pozitiflerde hücre duvarında teikoik asit vardır.

3. Mikobakterilerin fluorokrom (auramin-O) ile boyanması
Bu yöntemle auramin-O solusyonu karbol füchsin yerine kullanılır.
a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
b) Auramin-O solusyonu ile 15 dakika boyanır.
c) Su ile yıkanır ve asit - alkolde (alkol % 75'lik + 0.5 NaCL + % 0.5 HC1) dekolore edilir (5 dakika).
d) Su ile yakınır ve KMnO4 (1/1000) solusyonu onarak 30 saniye beklenir.
e) Su ile yıkanır, havada kurutulur ve immersiyonla muayene edilir. Tuberküloz etkenleri sarı-parıltılı olarak görülür.

Spor oluşturan mikroorganizmalarda, vegetatif hücre normal boyalarla boyanmasına karşın, sporun etrafında kalın muhafazaların bulunması ve bunların geçirgen olmaması boyanmalarını imkansızlaştırır. Spor boyamak için başlıca iki metot bulunmaktadır.

a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
b) Malaşit yeşili (% 5) solusyonu ile, alttan ısıtılarak, 5 dakika boyanır.
c)Su ile yıkanır. Safranin (%0,5) veya füchsin'le 30 saniye boyanır.
d) Su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyon objektifi ile muayene edilir.
Sporlar yeşil ve basiller ise kırmızı renkte görülürler.

Yukarıda bildirilen ve kurutulmadan yapılan lam-lamel arası muayene dışında, preparatlar kurutularak da incelenebilir.

a) Temiz bir lâm üzerine % 6 glukoz solusyonundan konur ve mikroorganizma (veya kültür) ile karıştırılır.
b) Bu karışıma bir damla nigrosin (veya çin mürekkebi) ilave edilerek homojen bir hale getirilir.
c) Diğer bir lâmın düzgün kısa kenarı ile ince bir tabaka halinde yayılır ve havada kurutulur.
d) Metil alkolle tesbit edilir.
e) Üzerine metil violet solusyonu konur ve 2 dakika bekletilir.
f) Su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyonla bakılır.
Bunların dışında, Giemsa ve diğer boyama tekniklerinden de yararlanılabilir.

a) Çok temiz, yağsız ve pürüzsüz 4-5 lam üzerine önce kalemle alttan halka şeklinde birer daire çizilir.
b) Bu dairelerin içine, formolle inaktivie edilmiş ve santrifüjle 2 defa yıkanarak konsantre edilmiş mikrop suspansiyonundan bir öze dolusu konur (suspansiyon için distile su kullanılır ve en son suspansiyon Brown-1 opasitesinde hazırlanır).
c) Bu suspansiyonların üzerine, özel olarak hazırlanmış tannik asitli basik fuchsin'den 1'er ml. konur ve 6,8,10,12 ve 15 dakika süreyle boyama yapılır.
d) Boya solusyonu çok hafif akan su ile yıkanarak giderilir.
e) Metilen mavisi ile 30 dakika boyanır.
f) Yıkanır, kurutulur ve immersiyonla bakılır. İyi bir görüntü için bazik fuchsin'le olan boyama süreleri ayarlanabilir.

Hücre içindeki lipidleri boyamada, genellikle, sudan siyahı kullanılır (Burdon metodu).

a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
b) Preparat üzerine sudan siyahı solusyondan konarak 15 dakikada boyanır.
c) Boya dökülür ve havada kurutulur.
d) Ksilol içinde yıkanır ve tekrar kurutulur.
e) Safranın (% 0,5 veya sulu fuchsin'le 5-10 saniye boyanır.
f) Boya dökülür su ile yıkanır kurutulur ve immersiyonla bakılır.
Mikroskop altında lipid granülleri mavi-siyah veya mavi-gri renkte görülürler. Bakteri protoplasması ise pembe boyanır.

a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve alevde tespit edilir (kesitler için genel fikzatiflerden yararlanılır ve etil alkol (% 70) içinde yıkanır).
b) Preparat periodat solusyonu ile 5 dakika muamele edilir ve sonra alkolle (% 70) yıkanır.
c) Redüktan solusyonla 5 dakika muamele edilir ve tekrar alkolde (% 70) yıkanır.
d) Fuchsin-sulfitle 15-45 dakika boyanır.
e) Sülfit yıkama solusyonu ile 2-3 defa yıkanır.
f) Sulu malaşit yeşili (% 0.002) ile boyanır.
g) Su ile yıkanır, kurutulur ve genel metotlara göre bakılır.

Bakterilerdeki nukleer materyali boyamada veya bu sistemi göstermede bazı yöntemler uygulanmaktadır. Bunlar arasında en yaygın olanı Robinow tekniğidir.

a) Üremiş kolonileri havi agar bloku kolonili yüzü üste gelmek üzere metil alkol içine 5 dakika bırakılır.
b) Blok çıkarılır ve havada kurutulur.
c) Blok tersine döndürülerek temiz bir lamel üzerine konur.
d) Agar blok kaldırır.
e) Lamel üzerine yapışan mikroorganizmalar havada kurutulur ve ılık alkol-merküri-klorid (Schaudin solusyonu) solusyonuna 5 dakika süre ile bırakılır.
f) Suda yıkanır ve % 70 alkolde bırakılır.
g) Alkolden çıkarılır ve 60 °C de 1 N HCl içinde 10 dakika müddetle tutulur.
h) Önce çeşme suyunda ve sonra da distile suda yıkanır.
i) Sonra, bufferli Giemsa (pH 7) solusyonunuda 37 °C de 30 dakika boyanır.
j) Suda yıkanır, kurutulur ve mikroskopla muayene edilir.

Bakterilerin hücre duvarını boyamada aşağıdaki yöntem fazla kullanılmaktadır.

a) Bakterilerden yukarıda bildirildiği gibi impresyon preparatı hazırlanır (lâm üzerinde).
b) Bouvin solusyonu ile fikse edilir.
c) Sonra, % 5-10'luk tannik asitle 20-30 dakika muamele edilir.
d) Kristal violet (% 0,02) ile 1 dakika boyanır.
e) Su ile yıkanır, kurutulur ve immersiyonla bakılır.

Spiroketaları boyamada, Fontana, modifiye Becker ve Levaditi yöntemleri kullanılır.

Mantar yönünden muayene, ya direk veya doku kesitlerinde mantar elementleri göstermek şeklinde uygulanır.

Riketsiyaları boyamada Castenada ve Macchiavello boyama yöntemleri genellikle kullanılır.

a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.
b) Karbol füchsin (1/10) ile 10 dakika boyanır.
c) Asetik asit (% 0.5) ile yıkanarak boya giderilir.
d) Su ile yıkanır.
e) Malaşit yeşili (% 1) ile birkaç saniye boyanır.Klamidia'lar kırmızı renkte ve noktacıklar halinde (tek tek veya kümeler) görülür.

2. Kullanma solusyonu (Löffler) : Metilen mavisi (stok) solusyon 33 cc ; distile su (% 0.01 KOH 'li) 100 cc. Önce distile su içine % 0.01 oranında KOH konur ve karıştırılır, sonra da 30 cc stok metilen mavisi solusyonu katılır ve iyice karıştırılır. Bir gün bekletildikten sonra filtre kağıdından süzülerek cam kapaklı şişelerde muhafaza edilir.

Bazik füchsin 10 g ; alkol 100 cc ; distile su (% 5 fenollü) 1000 cc. Bazik fuksin havanda alkolle ezildikten ve fenollü suyun yarısı ilave edilip karıştırıldıktan sonra bir şişeye aktarılır. Geriye kalan su tekrar havana konup iyice yıkandıktan sonra şişeye alınır. 24 saat bekletildikten sonra filtre kağıdından süzülür ve şişelerde muhafaza edilir.

Malaşit yeşili 1 g ; distile su 100 cc. Malaşit yeşili havana konur, distile su azar azar ilave edilerek ezilir ve şişeye alınır. Sonra suyun bir kısmı tekrar havana ilave edilerek havan yıkanır ve tekrar şişeye alınır. Bir gün bekletildikten sonra süzülür ve şişelerde saklanır.

Safranin 0.5 g ; alkol (% 95) 10.0 cc ; distile su 100.0 cc. Safranın alkolle eritilir ve sonra distile su ilave edildikten sonra şişeye konur ve bir gün sonra filtre edilir.

Bismarch brown (Y) 0.2 g ; distile su 100.0 cc. Boya damıtık su içinde eritilir, süzülür ve şişelerde saklanır.

Brillant yeşili 1.0 g ; sodyum hidroksit 0.01 g ; distile su 100.0 cc. Önce distile su içinde sodyum hidroksit eritilir. Sonra brillant yeşili havanda NaOH 'li distile su ile ezilerek eritilir ve süzülür.

Pikrik asit 0.75 g ; distile su 100.0 cc. Boya distile su içinde çalkalanarak eritilir. Ertesi gün filtre kağıdından süzülür.

Nigrosin 10 g ; distile su 100 cc. Nigrosin distile su içinde 1/2 saat kaynatılır. İçine 0.5 cc formalin (% 40'lık) koruyucu olarak katılır. Çift süzgeç kağıdından süzülür ve 5 cc miktarlarında ağzı kapalı tüplerde muhafaza edilir.

Auramin-O 0.3 g ; fenol (sıvı) 3.0 cc ; distile su 100.0 cc. Önce, fenol distile suya katılır ve hafifçe ısıtılır ve sonra auramin-O katılarak çalkalanır, eritilir ve filtre edilerek, koyu renkli şişelerde saklanır.

Metil violet 6 B 5 g ; distile su 1000 cc. Boya distile suya azar azar katılarak ve çalkalanarak eritilir. Filtre kağıdından süzüldükten sonra şişelerde saklanır.

Tannik asit 10 g ; NaCl 5 g ; Bazik fuchsin 4 g. Maddeler birbirleriyle iyice karıştırılır. Karışımdan 1.9 g. alınarak 33 cc alkol (% 95'lik) ilave edilir ve iyice erimesi sağlanır. Distile su ile 100 cc ye tamamlanır. Solusyonun pH 'sı 5.0 'e ayarlanır. Boya kapaklı şişelerde 3 - 5 °C 'de muhafaza edilir.

Sudan siyahı-B (toz) 0.3 g ; alkol (% 70) 100.0 cc. Boya, alkol içinde ara sıra çalkalanarak eritilir. Boya solusyonu bir gece bekletilir. Ağzı kapalı şişede muhafaza edilir.

1. Periodat solusyonu : Periodik asit 0.8 g ; distile su 20 cc ; Sodium acetat (0.2 M) 10 cc ; etilalkol 70 cc. Maddeler birbirine katılarak eritilir ve karanlık yerde muhafaza edilir.

2. Redükten solusyon : KI 10 g ; Sodyum thiosulfat (penta hidrate) 10 g ; distile su ; 200 cc. Karışım hazırlandıktan sonra 300 cc etil alkol ile 5 cc HCI (2N) ilave edilir. Sülfür presipite olur.

4. Sülfit yıkama solusyonu : Potasyum metabisülfit 2 g ; HCl (konsantre) 5 cc ; distile su 500 cc. Maddeler distile suya katılarak eritilir (solusyon taze hazırlanır).

Fenol kristal 20 g ; laktik asit 20 cc ; gliserin 40 cc ; distile su 20 cc ; pamuk mavisi (veya metil mavisi) 0.0075 g. Fenol, distile su içinde hafifçe ısıtılarak eritildikten sonra diğer maddeler katılır.