New Page 2
Bazı Önemli Biyokimyasal Testler

Bazı Önemli Biyokimyasal Testler

Prof. Dr. Mustafa Arda

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Temel Mikrobiyoloji
1

01. Genel Bilgiler
02. Bazı Önemli Testler
    02.01. Alkalin Fosfatase Testi
    02.02. Beta Galaktosidase (ONPG) Testi
    02.03. Dekarboksilase Testi (arginin-lisin-ornitin)
    02.04. Deoksiribonuklease (Dnase) ve Termonuklease Testleri
    02.05. Eskülin Ayrışması Testi
    02.06. Fenilalanin Deaminase Testi
    02.07. Fosfatase Testi
    02.08. Glukonat Oksidasyon Testi
    02.09. Hidrojen Sulfid Testi
    02.10. Hippurat Hidrolizasyon Testi
    02.11. İndol Testi
    02.12. Jelatin Hidrolizasyon Testi
    02.13. Karbonhidrat Fermentasyon Testi
    02.14. Katalase Testi
    02.15. Kazein Hidrolizasyon Testi
    02.16. Koagulase Testi
    02.17. Lesitinase (lipid hidrolizasyon) Testi
    02.18. Litmuslu Süt Testi
    02.19. Malonat testi
    02.20. Metil Kırmızısı Testi
    02.21. Niasin Testi
    02.22. Nişasta Hidrolizasyon Testi
    02.23. Nitrat Redüksiyon Testi
    02.24. Oksidasyon ve/veya Fermentasyon (O/F) Testi
    02.25. Oksidase Testi
    02.26. Potasyum Siyanid Testi
    02.27. Sitrat Testi
    02.28. Ürease Testi
    02.29. Voges - Proskauer (VP) Testi

01. Genel Bilgiler

Mikroorganizmaların (bakterilerin) cins ve türlerini ayırmada serolojik, antijenik ve patojenik karakterleri yanı sıra biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi de çok önemlidir. Türlerin saptanmasında bu testlerin sonucuna göre karar verilir. Biyokimyasal testler çabuk yapılması, ucuz olması ve kısa zamanda sonuçlanması gibi avantajları vardır. Hatta, bazen tür tespiti sadece biyokimyasal testlere göre yapılabilmektedir. Bu durum da, testlerin çok dikkatli, kontrollü yapılması ve çok iyi ayıraçların ve ortamların kullanılmasına bağlıdır.

Bakteriler biyokimyasal aktivite yönünden oldukça farklıdırlar. Aynı cins içinde bulunan türler veya hatta aynı türün farklı bireyleri arasında bile ayrılıklar meydana gelebilir. Bu değişmeler fenotipik veya genotipik özellikte olabilirler. Ayrıca, aynı birey her zaman sabit karakter de göstermeyebilir. Bazı özellikler, test koşullarında, değişik durumlar gösterebilir. Ancak, böyle variasyonları % 1 den aşağıdadır.

İşte yukarıda da açıklandığı gibi saf ve taze kültürler, sabit ve değerli olan (güvenilebilir) standart sonuçlar verebilir ve bunlarda tiplendirmede büyük ölçüde işe yararlar. Aşağıda mikroorganizma cinslerinin ve türlerinin belirlenmesinde kullanılabilecek bazı önemli biyokimyasal testler bildirilmiştir.

02. Bazı Önemli Testler

02.01. Alkalin Fosfatase Testi

Bu test, bazı mikroorganizmalarca (özellikle, Pseudomonas spp.) sentezlenen alkalin fosfatase enzim aktivitesini ortaya koymada uygulanır. Fosfatase enzimi, bir fosfomonoesterase olup fosfomonoester substratı üzerine etkilidir. Fosfat esterin hidrolizasyonu sonu inorganik fosfat ve alkol (R-OH) meydana gelir.

Bu reaksiyonda oksijen ile fosfor arasındaki bağ hidrolizasyon sırasında koparak fosfatmonoesterden inorganik fosfat serbest kalır.

Alkalin fosfatase enzimi, alkali pH koşullarında optimal akitviteye sahip olduğundan, bu adı almıştır. Bazıları ısıya dayanıklı olmalarına karşın, bir kısmı ise 70 °C de tahrip olmaktadır.

Materyal
1) Distile suda hazırlanmış % 1 p-nitrophenyl phosphate,
2) Tris buffer (0.02 M, pH 8.0)

3) Katı besiyerinde üremiş 24 saatlik Pseudomonas spp. kültürler.

Metot

Uygun katı bir besiyerinde üretilmiş ve önceden Pseudomonas spp. olarak identifiye edilmiş taze kültürden bir öze dolusu alınarak, tris buffer içinde homojen bir suspansiyon yapılır (MacFarland no 3 (9x108 hücre/ml), bundan 1 ml alınarak iki tüpe 0.5 ml miktarında taksim edilir (tüp-1 ve -2). Tüplerden biri (tüp-1), su banyosuna (70 °C) 20 dakika süre için konulur. Diğer tüp (2) ısıtılmadan oda sıcaklığında bırakılır (kontrol).

Yirmi dakikanın sonunda, her iki tüpe 0.5 ml miktarında % 0.1 p-nitrophenyl phosphate solusyonu (renksiz) konur ve iyice karıştırıldıktan sonra her iki tüp 37 °C de inkubasyona bırakılır. Bu süre bir saat ile 24 saat arasında değişebilir. Kuvvetli pozitif reaksiyonlar, genellikle, bir saat içinde ve koyu bir sarı renkte ortaya çıkar.

Değerlendirme

Tüplerin herhangi birinde sarı bir renk meydana gelmemiş ise, negatif olarak değerlendirilebilir. Ancak, böyle durumlarda, 24 saat kadar beklemek ve sonra karar vermek daha doğrudur. Sarı renk pozitif reaksiyonu ifade eder.
Pseudomonas türleri için
Termostabil: P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. boreopolis
1) Isıtılmış tüp : Pozitif reaksiyon (sarı renk)
2) Isıtılmamış tüp : Pozitif reaksiyon (sarı renk)
Termolabil : Diğer Pseudomonas spp.
1) Isıtılmış tüp: Negatif reaksiyon (renksiz)
2) Isıtılmamış tüp: Pozitif reaksiyon (sarı renk)
Pseudomonas olmayan türler için
1) Isıtılmış tüp: Negatif reaksiyon (renksiz)
2) Isıtılmamış tüp: Negatif reaksiyon (renksiz)

Bu reaksiyonda, renksiz olan p-nitrophenyl phosphate, fosfatase enziminin etkisi ile sarı renkli bir tuz olan p-nitrophenol ve inorganik fosfat halinde ayrışır.

Dikkat edilecek noktalar

1. Teste, pozitif (P. aeruginosa) ve negatif (S. epidermidis) kültürleri de kontrol olarak iştirak ettirilir ve değerlendirmeler bunlara bakılarak gözle yapılır.
2) Teste kullanılacak her iki çözelti de +4 °C kahve renkli şişelerde muhafaza edilir. Pozitif kontrol kültürlerde, zayıf veya şüpheli reaksiyonların elde edildiği durumlarda, reagentler yeniden taze hazırlanmalıdır.
3) Teste tabi tutulacak mikroorganizma, önceden Pseudomonas spp. olarak identifiye edilmiş olmalıdır. Bu test sadece Pseudomonas cinsi içinde bulunan türleri ayırmada kullanılmalıdır. Enterobacteriaceae familyasında bulunan bazı cinsler (Proteus, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Providence, E. coli) fosfatase enzimi sentezlerler. Ancak, bunların çoğu ısıya dirençlidir (termostabil). Bütün Pseudomonas türleri fosfotase enzimi sentezlerler. Bunların da büyük bir kısmı yüksek sıcaklıkta (70 °C 20 dakika) inaktive olurlar (termolabil). Bunlar arasında, P. aeruginosa, P. pseudomallei ve P. boreopolis 'e ait olanlar ısıya dayanıklıdırlar.
4) Testte kullanılacak tüm mikroorganizmalar, bileşiminde çok az oranda fosfat bulunan katı besiyerlerinde üretilmiş olmalıdırlar. Broth kültürleri kullanılmamalıdır.
5) Mikroorganizma suspansiyonları, fosfat buffer içinde yapılmamalıdır. Çünkü, fosfat molekülleri fosfatase aktivitesine mani olur.

02.02. Beta Galaktosidase (ONPG) Testi

Bu test, o-nitrophenyl - beta-D-galactoside'in (ONPG) ayrışmasını katalize eden beta-galaktosidase enziminin varlığının belirlenmesi amacıyla yapılmaktadır. Beta galaktosidase ortamda bulanan basit galoktozid'leri (laktoz dahil) ayrıştıran ve indüklenebilen intrasellüler bir enzimdir.

Bakterilerin, laktozu fermantasyon kabiliyeti, ortamda bulunan ONPG 'nin ayrışması için gerekli olan beta-galaktosidase enziminin varlığına bağlıdır. Eğer besiyerinde galaktosidase pozitif bir bakteri varsa, renksiz olan ONPG hidrolize edilerek, sarı kromojenik bir madde olan O-nitrofenol (ONP) serbest kalır. Pozitif reaksiyon da bu maddenin tespiti üzerine dayanır. Serbest kalan o-nitrofenol, alkali bir solusyonda bulunursa, tautometrik değişmelere maruz kalarak sarı renk meydana getirir.

Asit ortamlarda ise sarı renkli bir görünümdedir. Bu nedenle de ß-galaktosidase aktivitesini ölçmede, besi yerinin iyi buffer'lı olması gerekir.

Bu reaksiyon, özellikle, laktozu geç parçalayan veya şüpheli reaksiyon veren mikroorganizmalara kesinlik kazandırmada işe yarar. Böyle bakterilerin çoğu ß-galaktosidase pozitif reaksiyon vermektedirler. Pozitif reaksiyon laktozun fermente olduğunu gösterir.

Materyal

1) İçinde ONPG bulunan 5 ml miktarında sıvı besiyeri.
2) Muayene edilecek mikroorganizmaların saf ve taze sıvı kültürleri.
3) Kontrol pozitif (E. coli) ve negatif (P. morganii) suşların kültürleri

Metot

ONPG brothda mikroorganizmalar bolca ekildikten sonra 37 °C de 18-24 saat inkubasyona bırakılırlar. Sürenin sonunda kültürler santrifuje edilerek üst taraf atılır. Bakteri tortusuna 0.25 ml fizyolojik su ilave edilerek homojen bir suspansiyon yapılır. Buna bir damla toluene konularak iyice çalkalanır. Tüp 37 °C de 5-10 dakika su banyosuna bırakılır. Sonra, buna 0.25 ml ONPG solusyonu katılır ve tekrar su banyosuna 20 dakika ile 24 saat süre ile konulur. Tüplerdeki renk değişimine dikkat edilir. Tüplerde 20 dakika içinde bir değişiklik yoksa inkubasyona devam edilir.

Değerlendirme

Tüplerde sarı rengin meydana gelmesi ONPG nin hidrolize edildiğini (pozitif reaksiyon) ve renksiz olması da negatif reaksiyonu gösterir.

Dikkat Edilecek Noktalar

1) Kimyasal maddeler (ONPG, toluene, NaCl, vs.) saf ve en iyi kalitede olmalıdır.
2) ONPG solusyonu renksiz olmalıdır. Çalıştığı (etkinliği) pozitif ve negatif kontroller de denenmelidir.
3) İndikatörler buzdolabı sıcaklığında tutulmalıdır. Kullanılacağı zaman su banyosuna (37°C) konarak hafifçe sıcaklığı yükseltilmelidir (özellikle, ONPG solusyonu için).
4) Besiyerinin pH sının iyi ayarlanması gerekir, genellikle 7.5 civarında olmalıdır. Asit ortamda reaksiyon meydana gelmez.
5) Sarı pigment veren (kromojenik) bakterilerde, test, uygulanmamalıdır.
6) Ortamda glikoz bulunmamalıdır (ß galaktozidase aktivitesine mani olur).

02.03. Dekarboksilase Testi (arginin-lisin-ornitin)

Bu test, mikroorganizmaların, aminoasitlerdeki karboksil grubunu enzimatik olarak ayrıştırarak (dekarboksilasyon) amin ve korbondioksit meydana getirebilme yeteneğini belirlemek için kullanılır. Reaksiyon, dekarboksilase enzimi yardımıyla katalize edilir. Aminin meydana gelmesi ortamın pH sını yükseltir.

Testte kullanılan aminoasit dekarboksilase 'ler arginin, lisin ve ornitindir. Test, cins ve türleri birbirinden ayırmada önemli görevler yapar.

Mikroorganizma

Arginin

Lizin

Ornithin

Enterobacter cloacae

+

-

+

Enterobacter aerogenes

-

+

+

Salmonella typhi

+

+

-

Salmonella typhimurium

+

+

+

Proteus vulgaris

-

-

-

Klebsiella aerogenes

-

+

-

 

Dekarboksilasyon, irreversible ve nonoksidatif olup reaksiyon için koenzim pridoksal fosfata gereksinim gösterir. L-lisin aminoasidi, spesifik enzim olan lisin dekorboksilase yardımıyla dekorboksilize olarak kadaverin (diamin) ve karbondioksit meydana gelir.

L-orinitin aminoasiti, ornitin dekarboksilase spesifik enziminin katalitik etkisi ile bir diamin olan putresin ve karbondioksite ayrışır.

Bir aminoasit olan L-arginin başlıca 2 tarzda katabolize olur (arginin dehidrolase ve arginin dekarboksilase sistemleri).

1) Arginin dehildrolase sisteminde :

 

2) Arginin dekarboksilase sisteminde :

 

Yukarıdaki her iki reaksiyonda oluşan L-ornitin ve agmatin de daha ileri derecelere kadar katabolize olarak amin ve karbondioksite ayrışabilir. Dekarboksilase testi için bazı yöntemler (Moller, Falkow, vs.) geliştirilmiştir. Burada sadece Moller yöntemi bildirilmiştir.

Materyal

1) Her birinde ayrı ayrı % 1 oranında L-arginin, L-lisin ve L-ornitin bulunan 4-5 ml miktarında Miller ortamında birer tüp ve bir adet de kontrol (amino asitsiz) besiyeri, tüplerin üzerine 5 mm kalınlığında steril parafin konur.
2) Muayenesi yapılacak mikroorganizmaların saf ve taze sıvı kültürleri
3) Kontrol olarak K. aerogenes, P. vulgaris ve E. cloacae kullanılır.
4) Nessler ayıracı

Metot

Miller besiyerinin her birine, taze saf kültürlerden yeterince ekilir ve tüpler 37°C de 2-7 gün bırakılır. Kültürler her gün muayene edilir. Besiyerinde, önce glikozun fermantasyonu sonucu azot oluşması nedeniyle sarı bir renk meydana gelir. Sonra dekarboksilasyon meydana gelerek amin teşekkül eder ve besiyerinin pH sı yükselir ve mor bir renk alır (pozitif reaksiyon).

Değerlendirme

Pozitif reaksiyon :
Tüplerde mavi renk oluşumu
Negatif reaksiyon : Tüplerde sarı renk oluşumu
Kontrol tüp : Tüpte sarı renk oluşumu

Dikkat Edilecek Noktalar

1) Argininli tüpte pozitif reaksiyon meydana geldiğinde, besiyerinde amonyak (NH3) varlığı yönünden Nessler ayıracı ile kontrol edilmelidir.
2) Tüpler inkubasyonda uzun süre kalınca sarı ve mor renk meydana gelebilir. Bu durumda değerlendirmeden önce tüp hafifçe çalkalanmalıdır.
3) Tüplerin üzeri iyice işaretlenmelidir.
4) Amino asit içermeyen kontrol tüp, içindeki glikozun fermantasyonu sonu sarı renk göstermelidir.
5) Tüplerin değerlendirmesi 24 saatten önce yapılmalıdır. Çünkü, ilk defa sarı renk gösteren tüpler sonradan mor renk alırlar.
6) S. gallinarum, orinitini geç dekarboksilize eder (5-6 gün).
7) Tüplerin üstünde parafin bulunmalıdır. Çünkü, reaksiyon anaerobik koşullarda meydana gelir. Parafin, ekim yapıldıktan sonra ilave edildiği gibi, ekimden önce vasatla birlikte de sterilize edilebilir.

02.04. Deoksiribonuklease (Dnase) ve Termonuklease Testleri

Bu test, mikroorganizmaların ısıya dayanıklı olan deoksiribonuklease (DNase) enzimini sentezleyebilme yeteneklerini ölçmede kullanılır. Enzim, hücre çekirdeklerinde bulunan deoksiribonukleik asidi (DNA) depolimerize ederek ayrıştırır. Ayrıca, S. aureus 'ların DNase'lerinin ısı karşısında termonuklease stabilitesini ölçmede de yararlanılır.

DNase aktivitesi, özellikle, koagulaz negatif reaksiyon veren S. aureus 'ların patojenitelerini tayinde yardımcı olur. Bu yönden, S. aureus (+) ve S. epidermidis (-) dir. Ayrıca, birbirlerine yakın pigment vermeyen genuslardan Klebsiella – Enterobacter – Serratia 'ları ayırmada da kullanılır (Serratia spp. (+) Klebsiella ve Enterobacter (-) dir.

Termonuklease testinde, ısı karşısında, S. aureus tarafından sentezlenen DNase varlığı ortaya konur ve S. epidermidis ve diğer mikrokokların oluşturduklarından farkı ortaya konur. Nuklease enzimleri başlıca iki karakter taşır.
1) Endonuklease'ler internal pozisyonda bulunan fosfodiester bağlarını ayrıştırır.
2) Ekzonuklease'ler ise DNA molekülü terminusunda bulunan nukleotid'leri hidrolize eder. DNase, DNA'yı depolimerize ettiği gibi, aynı zamanda polimerizasyonu da katalize eden bir enzimdir.

DNase'ler birçok mikroorganizmanın ekstraksiyonundan elde edilebilir. Ekstrasellüler karakterde olanlar, S. aureus, grup A streptokok, C. diphteriae, S. marcescens, P. aeruginosa, Bacillus spp. ve Vibrio spp. 'den izole edildiği bildirilmiştir. Stafilokokkal DNase'ler hem S. aureus ve hem de S. epidermidis 'den elde edilmiştir. Bunlardan S. aureus 'unki ısıya dayanıklıdır (100 °C 15 dakika). Serratia DNase'leri nonspesifik fosfodiesterase'lerdir.

S. aureus ile Serratia marcescens DNase'leri arasındaki farklar aşağıda gösterilmiştir.

Özellikleri

S. aureus

S. marcescens

Aktivasyon için gerekli iyon

Ca++

Mg++ veya Mn++

pH sınırları

8.6 - 9.0

7.0 - 10.0

Isıya dayanıklılık (44°C ve yukarı)

termostabil

termolabil

Materyal

Kültür filtratlarında bulunan ekstrasellüler DNaseyi ölçmede aşağıdaki materyal kullanılır.
1) İçinde, son konsantrasyonu 2 mg/ml kadar olan DNA ile toluidin mavisi (% 1) bulunan agar plakları (Toluidin mavisi DNA agar)
2) Teste tabi tutulacak mikroorganizmaların (stafilokok suşları) saf ve taze sıvı kültürleri
3) Kontrol mikroorganizmalar pozitif (S. aureus) ve negatif (S. epidermidis) suşlar.
4) Hidroklorik asit (1 N HCl).

Metot

İncelenecek mikroorganizma kültürlerinden, petri kutusunda ki Toluidin mavisi DNA agar üzerine ortasına (bir noktaya) veya çizgi tarzında ekim yapılır. Petri kutusu 37 °C'de 2-3 gün inkube edilir. Bu sürenin sonunda, ekimin yapıldığı yerlerde üremenin etrafında parlak pembe bir açıklık meydana gelir. Eğer, besiyerinde Toluidin mavisi yoksa o zaman HCl (1 N, solusyonu agar üzerine yayılır.

Değerlendirme

1) Toluidin mavisi DNA agar üzerinde üreme etrafında parlak pembe açık sahanın oluşması DNase pozitif olarak değerlendirilir. Negatif olgularda bir değişiklik görülmez.
Toluidin mavisi içermeyen DNA agar üzerine HCl (1 N) ince bir tabaka halinde yayılır. Pozitif durumlarda üreme etrafında açık bir alan meydana gelir. Buna karşın negatif kültürlerde, üreme etrafında opak bir renk vardır.
2) Termonuklease ölçmek için ise, kültürler su banyosunda ısıtılır (kaynayan suda 15 dakika) ve soğutulur.
Toluidin mavisi DNA agar üzerinde açılan 5 mm çapındaki çukurlara ısıtılmış (kontrol) kültürlerden konulur. Petri kutuları 37°C de 2-4 saat inkube edilirler. Bu sürenin sonunda, etrafında parlak pembe renk oluşan çukurlardaki filtratlarda ısıya dayanıklı (termostabil) DNase (termonuklease) bulunmaktadır (pozitif reaksiyon). Pembe renk göstermeyenler ise negatif olarak kabul edilir (S. marcecens).

Isıtılmış

Isıtılmamış

S. aureus

+

+

Serratia marcescens

+

-

 

Dikkat Edilecek Noktalar

1) Kültürler taze olmalı ve yeterli bir üreme meydana gelmelidir.
2) Deneme çift olarak düzenlenmeli ve hem DNase ve hem de termonuklease akitvite ölçülmelidir.
3) DNase'lerin çoğu aktiviteleri için besiyerlerinde divalan katyonlara gereksinimleri vardır.
4) Negatif durumlarda, gerektiğinde inkubasyon süreleri uzatılabilir.

02.05. Eskülin Ayrışması Testi

Bu test, S. agalactiae ile S. faecalis 'i birbirinden ayırmada işe yarar. Bir glikozid olan eskulin, etkenlerin enzimleri vasıtasıyla hidrolize edilerek ayrıştırılır. Deney, eskulinli buyyon veya agarda uygulanabilir.

Materyal

1) İçinde eskulin bulunan buyyon (eskulinli buyyon, 5 ml) veya katı besiyeri (eskulinli agar)
2) Mikroorganizmanın saf ve taze kültürü
3) Kontrol pozitif (S. faecalis) ve negatif (S. agalactiae) mikroorganizma kültürleri

Metot

Üremiş mikroorganizmalardan sıvı ve katı besiyerlerine ekimler yapılarak 37°C 1-7 gün kadar inkube edilir.Kültürler her gün gözle kontrol edilirler.

Değerlendirme

1) Katı besiyerinde koloni etrafında oluşan siyahlanma eskulinin hidrolize olduğunu ifade eder (pozitif reaksiyon). Negatif durumlarda, hiçbir değişiklik görülmez.
2) Pozitif olgularda eskulinli brothda siyah-kahverengi renk meydana gelir.

02.06. Fenilalanin Deaminase Testi

Bu test, mikroorganizmaların enzimatik akitviteleri ile aromatik bir aminoasit olan fenilalanini oksidatif deamine ederek fenil pirüvik asit meydana getirebilme yeteneklerini ölçmede kullanılır.

Bu reaksiyonda fenil alanin, bir aminoasit oksidase enzimi olan flavo protein katalizörlüğü ile, oksidatif deaminasyona (NH2 grubunun çıkarılması) maruz kalması sonu bir keto asidi olan fenil pirüvik asit oluşur ve ortamın pH 'sı düşer.

Meydana gelen fenil pirüvik asit daha uzun süre inkubasyonda bırakılırsa, ileri derecelere kadar (fenil laktik asit) ayrılabilir. Sonra bu son ürün, fenilalanine tekrar dönüştürülebilir.

Materyal

1) İçinde DL-fenilalanin buluan katı besi yeri (pH 7.3, 5 ml)
2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (P. vulgaris) ve negatif (E. coli veya K. aerogenes) suşların kültürü
4) Ayıraç (% 10 ferri klorür, FeCl3)
5) Kontrol tüp (kontrol tüp)

Metot

Mikroorganizmalar ekildikten sonra tüpler 37 °C de 1-5 gün kadar inkubasyonda bırakılırlar. Sonra üzerilerine ayıraçtan 4-5 damla katılır ve tüpler hafifçe döndürülür (1-5 dakika).

Değerlendirme

Ayıraç ilavesinden sonra tüplerde kültürlerde ve solusyon içinde yeşil rengin meydana gelmesi pozitif olarak kabul edilir. Negatif durumda sadece ayıracın sarı rengi görülür.

Dikkat edilecek noktalar

1) Ayıraç taze hazırlanmalı ve önceden kontrol edilmelidir. Çözelti kahve renkli şişelerde ve buzdolabı sıcaklığında (+4°C) muhafaza edilebilir.
2) Reaksiyon çabuk okunmalıdır. Çünkü, oluşan yeşil renk kısa sürede açılabilir.

02.07. Fosfatase Testi

Bu test, özellikle, stafilokokların (koagulase pozitif) sentezledikleri fosfatase enzimini belirlemek amacıyla yapılır.

Reaksiyon, ortamda indikatör olarak bulunan fenolftalein difosfat'ı fosfatase enzimi yardımıyla ayrıştırarak serbest fenolftalein meydana getirir. Bu da alkali ile birleşince parlak pembe-kırmızı renk oluşur.

Materyal

1) İçinde, % 0.5 fenolftalein disfofat bulunan agar besi yeri (pH 7.3)
2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (S. aureus) ve negatif (S. epidermidis) suşlarının kültürü
4) Ayıraç (% 40 NaOH solusyonu veya yoğun amonyum hidroksid, NH4OH)
5) Ekilmemiş tüp (kontrol tüp)

Metot

Mikroorganizma kültürlerinden fenolftalein fosfatlı agara ekim yapılır ve 37 °C de 1-2 gün inkube edilir. Bu sürenin sonunda, koloniler amonyak buharına tutulurlar (petri kutusunun kapağına 1 ml NH4OH konur ve kültür ters olarak kapatılır). Eğer sıvı besiyeri kullanılmışsa, tüplere sodyum hidrositten bir damla damlatılır.

Değerlendirme

Kolonilerde veya tüpte kırmızı rengin meydana gelmesi pozitif reaksiyonu gösterir. Negatif durumda renk değişikliği olmaz.

Dikkat edilecek noktalar

Alkali ilavesi çok az veya çok fazla olmamalıdır. Yanlış sonuç verebilir.

02.08. Glukonat Oksidasyon Testi

Bu test, mikroorganizmaların glukonat (glukonik acid) okside edebilme yeteneğini ölçmede kullanılır. Glukonat'ın ayrışması sonu besi yerinde oluşan 2 ketoglukonat, ayrıçla ortaya konulur. Bu deneyden mikroorganizma cinslerini [E. coli (-), Enterobacter (+), Klebsiella (+) ve P. aeruginosa (+)] identifikasyonunda yararlanılır.

Materyal

1) İçinde glukonat (potasyum glukonat, potasyum glukonik asit) bulunan sıvı besi yeri (5 ml tüplerde),
2) Muayene edilecek mikroorganizmalar saf ve taze sıvı kültürleri,
3) Kontrol pozitif (Klebsiella aerogenes) ve negatif (E. coli) kültürleri,
4) Benedict'in ayıracı.

Metot

Mikroorganizmalardan yeteri miktarda glukonatlı besi yerlerine ekilir ve 37 °C de 2-3 gün inkübe edilirler. Bu sürenin sonunda kültürlere Benedict ayıracından 1 ml konur ve iyice karıştırılırlar. Sonra 100 °C de su banyosunda 10 dakika bekletildikten sonra okunur.

Değerlendirme

Tüplerde kahverengi - esmer renkte bir presipitasyonun meydana gelmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilir. Negatif olgularda ayıracın renginde (mavi) bir değişiklik olamaz. Meydana gelen presipitat genellikle renksiz bir görünümdedir.

 

02.09. Hidrojen Sulfid Testi

Bu test, mikroorganizmaların, sülfür içeren bazı aminoasitleri (sistin, sistein, metionin, glutation) veya bileşikler (sülfatları) ayrıştırarak hidrojen sülfür (H2S) meydana getirebilme durumlarını saptamak için yapılır.

 

Bu deney bakterilerin cins ve türlerini tayinde işe yarar. Sülfür içeren sistein başlıca iki tarzda ayrıştırılır.

Bu ikinci form, anaerobik katabolizmayı ifade eder. Besi yerinde bulunan sodyum tiosülfatın ayrışması da yandaki tarzda meydana gelir.

Kültürlerde oluşan hidrojen sulfiti ortaya koymak için çeşitli metal veya metaltuzları (kurşun, demir, nikel, vs) kullanılır. Bunlardan biri olan kurşun asetattan indikatör olarak fazlaca yararlanılır. Hidrojen sülfid renksiz bir gazdır.

Kurşun sulfatla birleşince kurşun sülfid meydana gelir ki bu madde siyah bir görünümdedir. Ortama indikatör olarak demir bileşiklerinin konulduğu durumlarda (örn, SIM besi yeri) demir sulfid (FeS) oluşarak siyah renk teşekkül eder. Hidrojen sulfid deneyinde, ya besi yerinden dışarı çıkan veya besi yeri içinde kalan hidrojen sülfid saptanır. Bu duruma göre de yöntemler değişebilir.

Besi yerinde oluşan hidrojen sülfüri ortaya koymada, TSI (triple sugar iron agar), Kligler demirli Agar (KDA) Sulfid İndol-Motile (SIM) yarı katı agar, pepton iron agar (PIA) Bismut Sulfid Agar (BSA) vs. katı veya yarı katı besiyerlerinden yararlanılır. Bunların hepsinde kükürt, sodyum tiosulfat (Na2S2O3) bileşiği halindedir. Oluşan kükürtlü hidrojeni ortaya koymada indikatör olarak ferro sulfat (FeSO4), ya da ferroamonyum sulfat (Fe (NH4)2 SO4), ferrik sulfat (FeC6H5O7) halindedir.

Besi yerinden dışarı çıkan kükürtlü hidrojeni belirlemede ise, kurşun asetat emdirilmiş steril kağıt şeritlerden yararlanılır.

Materyal

1) Tüpte hazırlanmış SIM yarı katı besi yeri (bu ortam hidrojen sülfürü ortaya koyması yanı sıra indol ve hareket muayenesi için de kullanılır).
2) Muayene edilecek mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri,
3) Kontrol pozitif (S. gallinarum, P. vulgaris) ve negatif (E. coli) kültürleri,
4) Eğer test sıvı ortamda yapılacaksa kurşun asetate emdirilmiş steril kağıt şeritleri (0.5 x 100 mm).

Metot

1) SIM besi yerine, mikroorganizma kültürleri batırılmış iğne ile dikine ekim yapılır.
) Sıvı besi yerlerine ekimler yapıldıktan sonra, sıvıya çok yakın gelecek tarzda kağıt şeritler sarkıtılır sıvıya değmemeli.
Tüpler 37°C de 2-7 gün inkubasyona bırakılarak her gün gözle kontrol edilirler.

Değerlendirme

1) SIM besi yerinde, inokulasyon hattı boyunca siyah rengin (demir sulfid, FeS) meydana gelmesi pozitif reaksioyn olarak değerlendirilir. Hiçbir değişiklik yoksa negatif olarak kabul edilir.
İnokulasyon hattından yanlara doğru yayılan üreme, hareketi ifade eder.
Besi yerinin üzerine Kovacs solusyonu konduğunda kırmızı rengin oluşumu indol'un varlığını bildirir.

2) Eğer sıvı ortamdan H2S çıkarsa, kağıttaki kurşun asetatla temasta kurşun sulfid meydana gelir ve kağıdın uç kısımları kararır (pozitif reaksiyon). Kağıtta hiç bir kararma yoksa negatif olarak değerlendirilebilir. Ancak, bu durumda sıvı kültüre 0.5 cc 2N HCl ilave edilir ve tekrar kağıt şerit konur.

Kültür içinde H2S kalmışsa hemen dışarı çıkar ve kağıt kararır. Bu zaman yine pozitif olarak kabul edilir.

Dikkat edilecek hususlar

1) Yöntemlerin kullanılması araştırıcıya bağlıdır. Gerektiğinde her iki yöntemden de yararlanılabilir.
2) Hidrojen sulfürün saptanmasında kullanılan besi yerleri arasında farklar vardır. Bazısında pozitif reaksiyon veren (SIM), diğerinde (TSI) negatif verebilir veya biri zayıf diğeri kuvvetli olabilir.
3) Sıvı besi yerlerindeki pepton içinde yeterince kükürtlü bileşik olmayabilir. Bu taktirde sisteinli sıvı besi yeri hazırlanmalıdır.
4) Kağıt şeritler sıvı besi yerine değmemelidir.

 

02.10. Hippurat Hidrolizasyon Testi

Bu test, bazı bakterilerce sentezlenen hippurat hidrolase (hippurilase) enzimi yardımıyla sodyum hippurat'ı (hippurik asit) hidrolize ederek benzoik asit ve glisin'e ayrıştırma yeteneğini belirlemede kullanılır.

Streptokokların tiplendirilmesinde yararlanılan bu test sadece ß-hemolitik olanlarda denenmelidir. Hippurat hidrolase enzimi intrasellüler, emolabil, antjenik olup optimal aktivite için pH 7.1 - 9.0 arası olmalıdır.

Materyal

1) Tüp içinde sodyum hippurat buyyonu (veya hippurat agar)
2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (S. agalactiae) ve negatif (S. uberis) kültürleri
4) Asid ferrik klorid (Fe3Cl3.6H2O + HCl)

Metot

1) Kültürlerden, hippuratlı buyyonlara ekim yapılarak 37 °C de 4-5 gün inkubasyona bırakılır.
2) Hippuratlı agara ekim yapılır ve bir hafta inkubasyonda tutulur.

Değerlendirme

1) Eğer hippurat ayrışarak fazla benzoik asit meydana gelmişse ve katılan indikatörlerle kahve renkli ve çalkalanınca erimeyen fazla bir presipitat meydana gelirse (pozitif reaksiyon). Eğer, presipitat oluşursa ve çalkalanır da hemen erirse veya hafif bir bulanıklık ve opelesans olursa negatif olarak değerlendirilir.
2) Hippuratlı agar kullanılmışsa, değerlendirme bir hafta sonra yapılır. Pozitif reaksiyonda üreme etrafında (koloni etrafında) pembe renk oluşur.

Dikkat edilecek noktalar

1) Test, önceden ß-hemolitik streptokok olarak belirlenen etkenler de uygulanmalıdır. Ancak bu test sadece streptokoklar için değildir. Diğer mikroorganizmalar da hippuratı ayrıştırabilirler.
2) Ferrik klorid ilave edildikten sonra tüpler iyice çalkalanmalıdır (10 dakika kadar).
3) Gerekirse hippurat agar kullanılabilir.

 

02.11. İndol Testi

Bu test, mikroorganizmaların bir aminoasit olan triptofanı ayrıştırarak indol meydana getirebilme yeteneğini belirlemek için kullanılır.

Aynı zamanda, bakterilerin cins (Salmonella (-), Edwardsiella (+), E. coli (+), Klebsiella (-), Enterobacter (+), ve türlerin (P. multocidea (+), P. haemolytica (-), P. mirabilis (-), P. vulgaris (+) ayırımında da işe yarar.

Materyal

1) İçinde triptofan bulunan sıvı besi yeri veya peptonlu su (tüpte, 5 ml).
2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (E. coli) ve negatif (S. gallinarum) kültürleri
4) Ekilmemiş sıvı besi yeri
5) Kovaks veya Ehrlich ayıracı

Metot

Mikroorganizmalar sıvı besi yerine veya peptonlu sıvıya ekildikten sonra 37 °C de 1-5 gün inkubasyona bırakılır. Kültürlerin üzerine kovacs (veya Ehrlich) ayıracından 0.5 ml ilave edilir ve iyice karıştırılır.

Değerlendirme

Tüplerin üst kısmında bir iki dakika içinde kırmızı bir halkanın oluşması pozitif reaksiyon (indol formasyonunu) ifade eder. Sarımsı halka indolun oluşmadığını gösterir (negatif indol testi). Renk, indol içinde bulunan pyrrole'den ileri gelir.

Dikkat edilecek noktalar

1) Ayıraçlar taze olmalı ve önceden iyice kontrol edilmelidir.
2) Ayıraçlar buzdolabı sıcaklığında (+4 °C) muhafaza edilmelidir.
3) Bazı peptonların içinde yeterince triptofan bulunmayabilir. Bu nedenle besiyeri triptofanlı hazırlanmalıdır.
4) Bileşiminde glikoz bulunan peptonlar indol testinde kullanılmamalıdır.
5) Triptofanase aktivitesi için ortam hafif alkali (pH 7.4 - 7.8) olmalıdır. Asit ortam, indol teşekkülünü azaltır.
6) Kültürler aerobik koşullarda inkube edilmelidir.

02.12. Jelatin Hidrolizasyon Testi

Bu test, mikroorganizmaların, jelatini hidrolize eden jelatinase enzim sentez yeteneğini ölçmede kullanılır. Bakterilerin identifikasyonunda işe yarar. Jelatin protein karakterinde bir madde olup kollagenin hidrolizasyonundan elde edilir.

yük moleküllü olduğundan bakteri hücre duvarından geçemez. Bu nedenle daha küçük moleküllere katalize edilir. Bu görevi de ekstra sellüler bir enzin olan jelatinase yapar. Jelatinase tarafından proteinlerin katabolizması iki aşamalıdır.

 

Uzun süre yüksek ısıda bulanan jelatin kısmen hidrolize olur ve katılaşma özelliğini kaybeder.

Materyal

Jelatinin hidrolizasyonunu saptamak için bir çok besi yerleri geliştirilmiştir. Bunlardan basit olanı tüplerde uygulanmaktadır.
1) İçinde % 10 oranında jelatin bulunan broth (5 ml tüplerde).
2) Denenecek mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri.
3) Kontrol pozitif (S. aureus) ve negatif (A. hydrophila) mikroorganizma kültürleri.

Metot

Mikroorganizma kültürlerinde değdirilmiş olan iğne, dik olarak jelatinli besi yerlerine daldırılır (yeterince ekim yapılmalıdır). Tüpler 37°C de 15 gün kadar inkube edilir. Bu süre sonunda kontrollerle birlikte buz dolabı sıcaklığında 1-2 saat bırakılır. Erimenin olup olmadığına dikkat edilir. Bu besi yerinde mikroorganizmalar iyi üremez ise diğer testler denenebilir (Frazier jelatin agar besi yeri).

Değerlendirme

Jelatinin hidrolize edildiği durumlarda, buzdolabından çıkarılınca, jelatinli ortamın sıvı halinde ve katılaşmadığı görülür (pozitif jelatin hidrolizasyonu). Negatif durumlarda tüpteki sıvı jelatinli besi yeri katılaşır.

Dikkat edilecek noktalar

1) İçinde % 12-14 jelatin bulunan broth oda sıcaklığında katı olmasına karşın 37°C de sıvı haline dönüşür. Bu nedenle, değerlendirmeyi buzdolabında tutulduktan sonra yapmak gerekir.
2) Kontrol tüpler çok önemlidir. Bunlara bakarak karar verilmelidir.
3) Kontrol mikroorganizmaların özellikle pozitif olan aktivitesi fazla olmalıdır.
4) Jelatin kültürleri çalkalanmamalıdır. Çünkü bazı mikroorganizmalar yüzeyde üreyip hidrolizasyonu burada yapabilirler.
5) Besi yerindeki jelatinin de iyi kalitede olması ve iyi hazırlanması gerekir. Fazla ısı, aktivitesini bozar ve yanlış sonuçlara götürür.
6) Bazı bakterilerin (stafilokok, salmonella, serratia) jelatinase aktivitesi için kalsiyum tuzlarına ihtiyaç vardır. Bu nedenle ortama 0.01 M CaCl2 katılabilir.
7) Mezofilik bakterilerin bir kısmı 22° - 25°C de üremektedirler. Bu durum dikkate alınmalıdır.
8) Bazı mikroorganizmalarda % 12-15 jelatinin üreme üzerine olumsuz etkisi olabilmektedir. Bu nedenle test değişikliği yapılmalıdır. Bu takdirde % 0.4 oranında jelatin içeren agar besi yeri kullanılmalıdır (Fraziler jelatin agar besi yeri).

02.13. Karbonhidrat Fermentasyon Testi

Bu test, mikroorganizmaların çeşitli spesifik karbonhidratları ayrıştırma yeteneklerini (sakkarolitik aktivite) belirlemek amacı ile yapılmaktadır. Mikroorganizmalar karbonhidratları, kendileri tarafından sentezlenen hidrolase (karbohidrase) enzimleri yardımı ile ayrıştırırlar. Ancak bu yetenek mikroplar arasında oldukça fazla değişiklik gösterdiği gibi, bir türe ait mikroorganizmalar arasında da ayrı fermentasyon özelliği gösteren variant suşlar da meydana çıkmaktadır. Bazı mikroorganizmaların fermentasyon özelliği yok denecek kadar az olmasına karşın Enterobacteriaceae familyasına ait olanlarda bu aktivite oldukça yüksektir.

Karbonhidratlar (monosakkarid, polisakkarid ve alkoller), bakteriler tarafından değişik tarzda (aerobik ve anaerobik) ayrıştırılarak çeşitli ürünler, organik asitler (asetik asit, butirik asit, formik asit, laktik asit, propionik asit, suksinik asit, vs.), nötral ürünler (Asetilmetilkarbinol, 2,3-butilenglikol, aseton, etil alkol, isopropil alkol, butil alkol, vs.) ve gazlar (hidrojen, oksijen, metan, karbondioksit) meydana gelirler.

Bu maddeler çeşitli testler yardımı ile ortaya konabilir ve mikroorganizmaların identifikasyonunda önemli göreve sahip olurlar. Enerji ve karbon kaynağı olarak, karbonhidratların önemi fazladır. Metabolize olabilenlerin üreme üzerine olumlu etkileri vardır. Ancak, ayrışma sonu oluşan organik asitler, besi yerinin pH sını düşürerek belli bir süre sonra üremeyi sınırlar ve durdururlar. Bu yönden de zararlı etkisi olur. Karbonhidratların aerobik ayrışması sonu çok fazla enerji ortaya çıkmasına karşın anaerobik ayrışmada (fermentasyon) enerji daha az çıkmakta ve organik asit oluşumu daha fazla görülmektedir. Laboratuvarlarda kullanılan besi yerleri ve diğer koşulların etkisi altında, mikroorganizma türlerine göre değişmek üzere, karbonhidratların ayrışması, genellikle, 1-10 gün arasında değişmektedir. Bazen daha uzun bir süreye gereksinim duyulabilir. Ayrışmayı ortaya koyabilmek için besi yerlerine üreme üzerine olumsuz etkisi olmayacak yoğunlukta bazı indikatörler (Andrade, bromkrezol moru, brom timol mavisi, fenol kırmızısı, vs.) katılır. Bunların özelliklerine göre renklerinde meydana gelen değişmeler ayrışmayı ve derecesini belirtir. Bu indikatörler besi yerlerine, yukarıdaki sıraya göre, % .005, % 0.0025, % 0.001 son konsentrasyonda olacak tarzda ilave edilirler. Andrade hariç olmak üzere diğerleri asit ortamlarda sarı renk meydana getirirler. Besi yerlerinde gaz oluşumunu saptamada, tersine yerleştirilmiş küçük Durham tüplerinden yararlanılır. Gaz, bu tüpün üst tarafında birikir. Bu amaçla özel Smith tüpleri de kullanılabilir. Nötral ürünlerden asetoin'i (asetil metilkarbinol) saptamada Voges Proskauer (VP) reaksiyonu laboratuvarlarca benimsenmektedir.

Materyal

1) İçinde % 1 oranında çeşitli karbonhidratları içeren indikatörlü ve Durham tüplü steril peptonlu su veya uygun bir sıvı besi yeri (4-5 ml). Durham tüpleri genelilkle glikoz'lu besi yerine konmaktadır (Salicin % 0.5, olarak hazırlanır).
2) Muayenesi yapılacak mikroorganizmanın taze saf kültürü.

Metotİyi üremiş saf kültürlerden 0.1 ml kadar alınarak ayrı ayrı karbonhidrat içeren tüplere ekilir ve iyice karıştırıldıktan sonra tüpler 37 °C de inkubasyona (1-10 gün) bırakılırlar. Tüpler her gün sabah-akşam, gaz ve asit oluşumu önünden muayene edilerek, kontrollerle birlikte, gözle değerlendirilirler. Gerektiği hallerde okuma süresi uzatılabilir.

DeğerlendirmeKullanılan indikatörün özelliğine göre aşağıdaki tarzda karar verilir:

İndikatör

Asit

Nötr

Alkali

Andrade

kırmızı

sarı

renksiz

Bromtimol mavisi

sarı

hafif mavi

mavi – koyu mavi

Bromkresol moru

sarımsı

morumsu

mor

Fenol Kırmızısı

sarı

renksiz

pembe

Yukarıda bildirilen renk değişmeleri pH durumlarına göre oldukça fazla farklılıklar göstermektedir. Bunları dikkate almak gereklidir.

Dikkat edilecek noktalar

1) Bazı peptonlar bileşimlerinde karbonhidrat içerdiğinden, bu test için uygun değildirler. Bu yönden dikkatli bulunmak gerekir.
2) Test için kullanılacak ortamlarda nitrat da bulunamamalıdır. Bu maddenin varlığı gaz podüksiyonunu önleyebilir.
3) Karbonhidratlar filtrasyonla sterilize edildikten sonra tavsiye edil
en miktar ve konsentrasyonlarda besi yerlerine katılırlar.
4) Durham tüpleri gerek görülürse, glikoz'lu tüp yanı sıra diğer karbonhidratlar için de kullanılabilir.
5) Sonuçlar, uygun bir süre sonra, kontrol tüplerle, karşılaştırılarak değerlendirilir. Mikr
oorganizma ekilmemiş, indikatörlü ve karbonhidratlı tüpler de denemeye iştirak ettirilmelidir.
6) Sonuçlar, pozitif (+) veya negatif (-) olarak belirtilmelidir.
7) Mikroorganizmaları iyi üretmek için besi yerlerine katılan serumlarda bulunan enzimler, ma
ltoz'u glikoz'a ayrıştırabilir. Bu nedenle, serumların inaktive edilmesinde yarar vardır.
8) Anaerobik mikroorganizmalar için anaerobik koşullar sağlanmalı ve yeterli süre ayrılmalıdır.
9) Katı besi yerleri de aynı amaçlar için kullanılabilirse de sıvı ort
amlar laboratuvarlarca daha fazla tercih edilmektedir. Son yıllarda çeşitli karbonhidratlara emdirilmiş steril kağıt disklerden de yararlanılmaktadır.
10) Değerlendirilmelerde kullanılan indikatörün pH limitlerine göre aldığı renk değişimlerini çok iyi bil
mek gerekir.

02.14. Katalase TestiBu test, bazı mikroorganizmalarca sentezlenen katalase enzimini (hidrojenperosid oksidoredüktase) saptamak amacıyla yapılır ve identifikasyonda kullanılır. Bu enzim ekseri sitokrom ihtiva eden aerobik bakterilerde ve bazı fakültatiflerde bulunur. Katalase bir hemeprotein olup prostetik grubunda, her molekülde, 4 atomlu ve 3 değerli demir (Fe+++) bulunur. Enzim, hidrojen peroksid'i (H2O2) su (H2O) ve oksijene (O2) ayrıştırır. Hidrojen peroksidin ayrışmasında, bir molekülü substrate donor olarak görev yapar.

Substrat ve suda donorun hidrojeni yardımı ile redükte olur ve böylece, substrat redükte, donor da okside olur.

Bakterilerde hidrojen peroksidin ayrışmasında başlıca iki enzim etkili olabilmektedir. Bunlardan biri, katalase ve diğeri de peroksidase'dir. Hidrojen peroksidin dışında diğer bazı substratlar da katalase enzimi tarafından kullanılabilirler. Bunlar arasında, alkoller (etanol), hidratlanmış formaldehid (H2C(OH2), nötröz asidi (HNO2) ve formik asit (HCOOH) vardır. Katalase enzimi, hidrojenperoksidi, metilalkol'u (CH3OH) ve etlalkol'u (C2H5OH) okside etmek için kullanılabilir.

Materyal

1) Taze hazırlanmış hidrojen peroksid solusyonları (% 3 ve % 30)
2) Muayenesi istenen mikroorganizmaların taze (18-24 saatlik) sıvı veya katı besiyerindeki kültürleri
3) Bilinen ve kontrol olarak kullanılacak, pozitif (S. aureus) ve negatif (S. faecalis) taze kültürleri.

Metot

1) Katı besi yerinde (kanlı agar hariç) üremiş olan mikroorganizma kolonilerinden platin öze (veya cam baget) yardımı ile yeterli miktarda alınarak temiz ve yağsız bir lamın üzerine konulur. Sonra buna % 30 luk hidrojen peroksidden bir damla damlatılır veya
2) Sıvı besiyerinde (5 ml) üremiş kültür üzerine % 3 lük hidrojen peroksid'den 3-4 damla ilav
e edilir.

Değerlendirme

Hidrojenperoksid katılmasından sonra kabarcıkların görülmesi veya çıkması pozitif reakiyon olarak değerlendirilir. Şüpheli durumlarda mikroskop altında muayene yapılabilir. Reaksiyon en iyi pH 7.0 da meydana gelir ve oda sıcaklığında yapılır. Sonuçlar, negatif (-), zayıf (+), orta (++) ve kuvvetli (+++) pozitif olarak derecelendirilir.

Dikkat edilecek hususlar

1) Mikroorganizmaları üretmede kullanılan katı besi yerinde kan bulunmamalıdır. Bunun yerine, eğer zorunlu ise, çikolata agar denenebilir.
2) Lam üzerinde uygulanan yöntemde, aerosol infeksiyonlara veya deri-göz konjonktivasına etkenin sıçraması sonu hastalanmalara rastlanabilir. Bu yönden dikkatli bulunulmalıdır.
3) Hidrojenperodsid dayanıksızdır. Bu nedenle taze hazırlanmalı
ve kullanılıncaya kadar buz dolabı sıcaklığında muhafaza edilmelidir.
4) Testte kontrol mikroorganizmalar bulundurulmalıdır (S. aureus ve S. faecalis).
5) Muayene edilecek kültürler 18-24 saatlik olmalıdır. Eski kültürler yalancı negatif reaksiyon verebil
irler.
6) Hidrojenperoksid (% 30) deri için zararlı bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, % 70'lik alkol daima hazırda bulundurmalı ve gerekitği zaman deriye sürülmelidir.
7) Test oda sıcaklığında yapılmalıdır. Asit ortamlar, katalase aktivitesini önlediğinden,
nötr pH 7.0 tercih edilmelidir.
8) Yalancı pozitif reaksiyonlar, kirli malzeme kullanılmadığında görülebilir. Bu nedenle bütün cam malzemenin kimyasal yönden temiz olması gereklidir.
9) Eğer, anaerobik koşullarda üretilmiş kültürlerin yoklaması söz konusu
ise, bu takdirde, kültürler teste tabi tutulmadan önce 30 dakika açık havada bulundurulmalıdırlar.

02.15. Kazein Hidrolizasyon TestiBu test, sütün proteinini oluşturan ve kolloidal karakterde bulunan kazeinin, bakterilerce sentezlenen, proteolitik ve ekstrasellüler bir enzim olan protease tarafından hidrolize edilebilme durumunu saptamak için kullanılır. Mikroorganizmaların türlerinin identifikasyonunda işe yarar.

Materyal

1) İçinde % 10 yağsız süt bulunan agar (sütlü agar)
2) Mikroorganizmaların saf v
e taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (B. subtilis) ve negatif (E. coli) mikroorganizma kültürleri
4) Ekilmemiş besi yeri
5) Gerektiğinde sütlü sıvı besi yeri de kullanılabilir.

Metot

Sütlü agar besi yerine çizgi tarzında mikroorganizmalar ekilir ve petri kutusu 37°C de 2-14 gün kadar inkubasyona bırakılır. Petri kutuları her gün, kontrollerle karşılaştırılarak, muayene edilirler.

DeğerlendirmeSüre sonunda koloniler etrafında oluşan açık alan, sütteki kazeinin hidrolize olduğunu ifade eder (pozitif reaksiyon). Negatif durumlarda koloni etrafında hafif opaklaşma görülür.

Dikkat edilecek noktalar

1) Sonucu iyi değerlendirmek için Petri kutuları siyah bir zemin üzerine konulur.
2) Sütte bulunan laktozu fermente eden mikroorganizmalar asit oluşturmaları nedeniyle süt proteininde değişmeler meydana getirebilir ve açılmalara yol açabilir. Bunu anlamak için, petri kutusuna % 1 HCl veya % 1 Cıva klorür solusyonundan konur. Eğer açılan sahaların rengi kaybolursa, kazein hidrolize olmamıştır.

02.16. Koagulase Testi

Bu test, özelilkle stafilokoklarda bulunan ve kan plazmasını pıhtılaştıran koagulase enzimini (stafilokoagulase) ortaya koyma, patojenik olanlarla nonpatojenik olanları ayırmak amacı ile yapılır. Patojenik olan S. aureus pozitif reaksiyon vermesine karşın S. epidermidis ve S. saprophyticus negatif reaksiyon gösterir. Aslında koagulase'nin patojenite ile ilişkisi de tam olarak aydınlatılmamıştır.

Protein karakterinde, ekstrasellüler, ısıya dayanıklı (60 °C ve 30 dakika) olan koagulase DNA'yı da ayrıştırdığı için bir deoksiribonüklease (DN'ase) karakteri taşır. Pıhtılaşmanın normal mekanizması kısaca yanda gösterildiği gibidir.

Bazı araştırmacılar, koagulase enzimini, normal plasma faktörü ile reaksiyon vererek trombin benzeri subtansı oluşturan ve protrombin benzeri bir madde olduğunu da bildirmişlerdir. Bu madde sonradan fibrinojen'i aktive ederek fibrin haline dönüştürür. Stafilokoklar dışında bazı mikroorganizmalar da koagulasyon meydana getirebildikleri saptanmıştır. Ancak buradaki reaksiyon enzimatik olmayıp, plasma antikoagulatanın tahrip olması etkisinin ortadan kalkmasıyla meydana gelir. Koagulase enziminin fazla olması reaksiyonun daha çabuk ve belirgin olarak meydana gelmesine neden olur. Stafilokoklarda koagulase aktivitesinin, bu etkenlerinin oluşturduğu diğer toksik substanslarla bir bağlantısı olmadığı bildirilmiştir.

Materyal

1) Steril taze insan veya tavşan plasması (heparinli veya fibrinojen)
2) Taze ve saf stafilokok sıvı veya katı ortamdaki kültürü
3) Koagulase pozitif (
S. aureus) ve negatif (S. epidermidis) suşlarının taze kültürleri (kontrol mikroorganizmalar)

Metot

1. Tüpte test: Temiz bir tüpe (13 x 100 mm) 0.5 ml kadar plasma konur. Üzerine aynı miktar S. aureus kültürlerinden damlatılır ve homojenize edilir. Sıvı kültür yerine, katı besi yerinden alınmış bir-iki saf koloni de, plasma içinde homojen bir suspansiyon yapılabilir. Eğer elde yeterince plasma varsa, bu amaç için iki ayrı tüp kullanılabilir.Tüpler 37 °C de su banyosunda 1-3-6 saat tutulur ve her saat gözle kontrol edilirler.Tüpler çok hafifçe eğilerek koagulasyon durumu belirlenir.2. Lamda test: Temiz bir lam üzerine bir damla steril fizyolojik su (veya distile su) konur. Buna taze sıvı stafilokok kültüründen bir damla ilave edilir veya agardan bir-iki koloni alınarak sıvı ile bir suspansiyon yapılır. Sonra bunun üzerine bir damla steril taze plasma konur ve homojenize edilir. Reaksiyon 3-5 saniye içinde okunabilir. Şüpheli durumlarda sonucu almak için 2-3 dakika kadar beklenebilir.

Değerlendirme

1. Tüp testinde: Tüp içinde bulunan plasmanın tam pıhtılaşması (fibrin oluşumu) pozitif reaksiyon olarak değerlendirilir. Eğer fibrin oluşumu tam değilse (kısmi koagulasyon) 24 saat 35° - 37° C de tekrar bekletilmelidir. Hiçbir pıhtılaşma yoksa, suspansiyon ilk baştaki gibi homojen ise, negatif reaksiyon olarak kabul edilir. Gerekirse, 24 saat yeniden inkubasyona bırakılabilir. Değerlendirme kontrollerle karşılaştırılarak yapılır.
2. Lam testinde: Lam üzerinde 3-5 saniye içinde oluşan kümeleşme pozitif reaksiyon olarak ka
bul edilir. Bu süreden sonra bir dakikaya kadar olan kümeleşmeler geç reaksiyon olarak değerlendirilir. Bir dakikadan sonraki reaksiyonlar şüpheli ve hiçbir değişiklik yoksa negatif olarak dikkate alınır. Şüpheli ve geç reaksiyon hallerinde tüp testi ile duruma kesinlik kazandırılır.

Dikkat edilecek noktalar

1) Testte eski ve zayıf üreyen kültürler kullanılmamalıdır, geç ve şüpheli reaksiyonlar görülebilir.
2) Kanın sitratlı alınmaması daha uygundur. Bunun yerine heparin tercih edilmelidir.
3) Kullanılacak plasma taze olmalı ve filtrasyona tabi tutulmamalıdır.
4) Tüp veya lâmlar hiçbir zaman kuvvetlice çalkalanmamalı ve sallanmamalıdırlar. Hafifçe eğilerek reaksiyon gözlenir. Aksi halde pıhtı parçalanır şüpheli veya negatif
reaksiyon meydana gelir ve pıhtı
oluşmaz.
5) Lam testinde, fizyolojik su (veya distile su) ile kültür homojen olarak karıştırıldıktan sonra, yalancı granulasyon (otoaglutinasyon, pseudokoagulasyon'un) olup olmadığına dikkat edilir. Eğer, otoaglutinasyon yoksa teste devam edilir.
6) Bazı a
raştırıcılar plasmayı ve bakteri kültürünü 1/2 - 1/5 oranlarında sulandırmayı tavsiye etmektedirler. Ancak bu konuda tam bir görüş birliği yoktur. Her iki komponentte eşit miktarlarda reaksiyona konulmalıdır.
7) Plasma soğuk olarak kullanılmamalıdır. Oda sıcaklığında olmalıdır.

02.17. Lesitinase (lipid hidrolizasyon) Testi

Bu test, yumurta sarısında bulunan lipoprotein komplekslerinin bakteriler tarafından oluşturulan lesitinase ve fosfolipase enzimleri ile hidrolize edilebilme durumunu belirlemek için yapılır.

Materyal

1) Yumurta sarılı agar
2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (
S. aureus) ve negatif (B. subtilis) mikroorganizma kültürleri
4) Ekilmemiş tüpler

Metot

Mikroplar yumurta sarılı besi yerine ekildikten sonra 37°C de 1-7 gün inkube edilirler. Kolonilerin etrafındaki açılmalara dikkat edilir.

Değerlendirme

Koloniler etrafında lesitin hidrolizasyonu sonu oluşan açılmalar ve opaklaşmalar pozitif olarak değerlendirilir. Bu alanın çapı mm olarak ölçülür.

02.18. Litmuslu Süt Testi

Bu test, mikroorganizmaların litmus katılmış sütte üremelerini ve sütte meydana gelen değşiiklikleri (litmusun renginin açılması veya koyulaşması, sütün pıhtılaşması, vs.) incelemek amacıyla yapılır. Süt içerdiği maddeler (protein, laktoz, mineral maddeler, vitaminler, yağ, vs.) nedeniyle çok iyi besleyici bir ortam olduğu gibi, mikroorganizmaları da üretici bir niteliğe sahiptir. Bakteriler ürerken laktozu ayrıştırarak oluşturdukları organik asitler nedeniyle pH'nin düşmesine ve bunun sonucu litmus'un renginin acılmasına neden olurlar. Asit ortam aynı zamanda süt proteini olan kazeinin pıhtılaşmasına da yol açar. Laktozun ayrışma ürünleri arasında meydana gelen gazlar da, süt pıhtısının parçalanmasına sebep olurlar.

Meydana gelebilecek değişiklikleri kolay görebilmek için süte katılan litmus (veya brom kresol purpul, klorfenol kırmızısı, metilen mavisi) nötral pH da leylak kırmızısı rengindedir. Asit ortamda açık pembe ve alkalide de mavi bir renk alır. Litmus aynı zamanda, sütteki, oksidasyon ve redüksiyon için de bir indikatördür. Redüksiyon, sütün renginin açılmasını (beyazımsı) sağlar. Süt pıhtılaşınca, üst kısmında sarımsı bir sıvı oluşur (süt serumu). Pıhtı sonradan peptonize olur ve eriyebilir.

Materyal

1) İçinde litmus bulunan sütlü besi yerleri
2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (
E. coli asit ve A. faecalis alkali) ve negatif (P. vulgaris) mikroorganizma kültürleri
4) Ekilmemiş litmuslu süt.

Metot

İndikatörlü süte mikroorganizma ekildikten sonra 37 °C de 1-7 gün inkübe edilir. Her gün oluşan değişikliklere dikkat edilir.

Değerlendirme

1) Sütle laktozun ayrışması sonu asit meydana gelmesi, Litmus'un renginin pembeleşmesine ve aynı zamanda sütün pıhtılaşmasına neden olur.
2) Sütteki amino asitlerin ayrışması sonucu oluşan amonyak pH'nın yükselmesine ve ortamın mavi renge dönüşmesine yol açar.
3) Litmusun redüksiyonu renginin beyaz sarı olmasına sebep olur.
4) Gaz teşekkülü (CO
2, H2) pıhtının parçalanmasını sağlar.
5) Süt pıhtısının proteolitik enzimler sonucu hidrolizasyonu (peptonizasyon) sütlü ortamın berraklaşmasına neden olur.

Dikkat edilecek noktalar

1) Bu test, mikroorganizmaların identifikasyonlarında ikinci derecede kullanılır.
2) Süte, bromkresol purpul katıldığı durumlarda, nötral sütte gri-mavi, asitte sarı ve alkalide mavi renk meydana gelir.
Klorfenol kırmızısı bulunan sütte, sarı-yeşil renk asidi, kırmızı-mavi alkaliyi, mavi-yeşil oksidasyonu, beyaz renk redüksiyonu ve mavi-gri renkte hiçbir değişikliğin
olmadığını ifade eder.
3) Süt fazla kaynatılırsa karamelize olabilir.
4) Homogenize süt kullanılmamalıdır.

02.19. Malonat testi

Bu test, mikroorganizmaların besi yerlerine konan malonat'tan karbon kaynağı olarak yararlanabilme yeteneğini ölçmede kullanılır. Mikroorganizma cinslerini (Arizona (+), Salmonella (-), Klebsiella ve Enterobacter (+), E. coli (+) ayırmada işe yarar.

Materyal

1) Sodyum malonat buyyonu (açık yeşil renkte, pH 6.7, tüpte 5 ml)
2) Mikroganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (K. aerogenes) ve negatif (E. coli) suşlarının kültürleri
4) Yeterince ekilmemiş besi yeri

Metot

Kültürlerden buyyonlara ekim yapıldıktan sonra 37°C de 2-3 gün inkube edilir. Tüpler her gün gözle kontrol edilir.

Değerlendirme

Mikroorganizma tarafından malonatın kullanıldığı durumlada ortamın pH'sı 7.6 yükselebilir. Böyle alkali ortamda Prusya mavisi renk ortaya çıkar (pozitif reaksiyon). Herhangi bir reaksiyonun olmadığı durumlada, besi yerinin orijinal rengi (açık yeşil) muhafaza edilir (negatif reaksiyon). Glikozun fermentasyonu durumunda sarı renk meydana gelir (pH 6.0).

Dikkat edilecek noktalar

1) Bazı malonat pozitif mikroorganizmalar hafif alkali oluşturabilirler. Bunları değerlendirmede güçlük çekilir. Bu zaman inokule edilmemiş tüplerle kontrol edilir. Hafif mavilikte olsa pozitif olarak değerlendirilir.
2) Bazı malonat negatif bakteriler sarı renk meydana getirirler (glikoz fermentasyonu).

02.20. Metil Kırmızısı Testi

Bu test, glikozun fermentatif metobolize olması sonu besi yerinde organik asitlerin meydana glediğini ve pH'nın düştüğünü ortaya koymak için yapılır. Deney, mikroorganizma cinslerinin (E. coli +, Enterobacter aerogenes -, E. cloacae -) ve türleri (L. monocytogenes +) ayırmada kullanılır. Metil kırmızısı solusyonu pH 6.0 da sarı renk ve pH 4.4 den aşağıda kırmızı renk gösterir.

E. coli tarafından glikozun ayrıştırılması yanda gösterilmiştir.

Materyal

1) Tüpte hazırlanmış Clark ve Lubs besi yeri (MR/VP buyyonu)
2) Saf ve taze mikroorganizma kültürleri
3) Kontrol pozitif (E. coli) ve negatif (E. cloacae) mikroorganizma kültürleri
4) Metil kırmızısı pH indikatörü
5) Ekilmemiş besiyerleri

Metot

Üremiş kültürlerden, besi yerlerine ekimler yapılır ve tüpler 37 °C de 2-7 gün inkubasyona bırakılır. Üzerine metil kırmızısı solusyonunundan 4-5 damla damlatılır ve iyice karıştırılır.

Değerlendirme

Metil red, besi yerine damlatıldıktan sonra üstte kırmızı renkli bir halkanın meydana gelişi pozitif metil kırmızısı testi olarak kabul edilir. Negatif reaksion halinde üst tarafta sarı bir halka görülür.

Dikkat edilecek noktalar

1) Kültürlerin yeterince inkubasyonda kaldıktan sonra test uygulanmalıdır.
2) Besi yerine katılan peptonların metil kırmızısı testi üzerine etkisi fazladır. Ayıraç, iyice kontrol edilmiş olmalıdır.
3) Besi yerlerinde glikoz oranı % 0.5 den aşağı olmamalıdır ve fosfat buffer içermelidirler.
4) Laboratuvarlar, kendilerine en uygun besi yerini, miktarını, üreme durumunu, vs. hususları dikkate alarak testi uygulamalıdırlar.

02.21. Niasin Testi

Bu test, insan tipi tuberküloz etkenini (M. tuberculosis) ayırmada kullanılır. Bu etken kültürlerde ürediği zaman niasin (nikotinik asit) sentezler. Deney, bu maddeyi ortaya koymak için uygulanır.

Materyal

1) Renksiz tuberküloz besi yeri (Dubos, Dorset, vs.)
2) Üremiş saf tuberküloz kültürü
3) Kontrol pozitif (insan tipi Tb etkeni) ve negatif (M. bovis) suşlarının kültürü
4) Ayıraç (siyanogen bromid (CNBr) ve etanol'lu anilin

Metot

Tuberküloz mikroorganizması (M. tuberculosis) adı geçen besi yerlerine ekilerek 37°C de 2-3 hafta inkube edilir. İyi bir üremenin meydana gelmesi sağlanır. Kültürlerden yeteri miktarda alınarak tüpte suspansiyon yapılır ve iyice karıştırılır. Tüpe önce % 4 lük etanollu anilin'den 0.6 ml. konur ve sonra da 0.6 ml. % 10 luk siyonojen bromid ilave edilir.

Değerlendirme

Tüp içinde sarı rengin meydana gelmesi niasin'in varlığını ifade eder (pozitif reaksiyon).

Dikkat edilecek noktalar

1) Siyanojen bromid toksiktir. Kullanırken dikkat edilmelidir.Test bittikten sonra tüpe alkali (10 N NaOH) katılarak (veya % 10 amonyak) ayıraç detoksifiye edilir.
2) Test, bir steril kabinet içinde uygulanmalıdır.
3) Bazı kromojenik mikobakteriler testte sarı renk meydana getirebilirler.

02.22. Nişasta Hidrolizasyon Testi

Bu test, bir homopolisakkarid olan nişastanın, bazı mikroorganizmalarca sentezlenen ekstrasellüler amilase enzimi tarafından hidrolizasyonunu ortaya koymak amacı ile yapılır. Ayrıca bu test bakteri cins ve türlerinin belirlenmesinde de yardımcı olur. Nişastanın glikoz'a kadar olan ayrışma aşamaları yanda gösterilmiştir.

Materyal

1) Petri kutularında hazırlanmış nişastalı agar besi yerleri
2) Denenecek mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol mikroorganizmalar [(E. coli (-) ve B. subtilis (+)]
4) Lugol solusyonu veya % 95 etanol
5) Test, agar üzerinde olduğu gibi, sıvı kültürler (nişastalı buyyon) içinde de yapılabilir.

Metot

Nişasta hidrolizasyon aktivitesi ölçülecek mikroorganizmadan nişastalı agar üzerine çizgi tarzında ekimler yapılır ve 37°C de 2-5 gün inkube edilirler.

Diğer bir besi yeri de iki kısma ayrılarak her bir yarımına kontrol mikroorganizmalar ekilir.

Değerlendirme

1) İnkubasyon süresinin sonunda agarların üzeri lugol solusyonu ile kaplanır. Pozitif reaksiyonlarda, koloni etrafında renksiz bir halka oluşur (alfa-amilase enziminin nişastayı hidrolizasyonu sonu). Negatif durumlarda besi yeri mavi renkte görülür. Koloni etrafındaki oluşan pembe-esmer bölge şüpheli reaksiyonu ifade eder. Reaksiyon 5 dakika içinde okunmalıdır.
2) Petri kutuları üzerine lugol solusyonu yerine 8-10 ml % 95 etanol'de konulabilir. Nişastanın hidrolizasyonu halinde koloni etrafında açık alan meydana gelir (pozitif amilase). Negatif durumlarda bu alan süt beyazı görünümündedir. Reaksiyon 30 dakika içinde okunur. Her iki yöntemde de lugol ve etanol döküldükten sonra değerlendirme yapılır.

Dikkat edilecek noktalar:

1) Nişastalı katı veya sıvı besi yerleri çok fazla ısıtılmamalıdır.
2) Besi yerleri nötr (pH 7.2) olmalıdır.
3) Nişastalı besi yerleri taze oldukları zaman daha belirgin ve çabuk sonuç verirler. Eski besi yerleri ise opaklaşır ve yanlış değerlendirmelere yol açar.
4) Besi yerlerinde, alfa -amilase aktivitesi için klorid iyonları bulunması gereklidir. Bu nedenle klorid iyonlarının en az 0.01 M konsentrasyonunda olması gereklidir.
5) Besi yerlerinin buzdolabında bulunması ve muhafazası opaklaşmaya yol açar.
6) Testte kullanılan lugol solusyonu 1/5 sulandırılarak kullanılır. Saf lugol yanlış negatif sonuçlara yol açar.
7) Lugol solusyonu besi yeri üzerinde 5 dakika (etanol 30 dakika) tutulduktan sonra dökülür ve değerlendirme yapılır.

02.23. Nitrat Redüksiyon Testi

Bu test, mikroorganizmaların nitratları redükte edebilme yeteneğini belirlemede kullanılır.

Bazı bakteriler nitratları (NO3) redükte ederek nitritlere (NO2) ve hatta daha ileri basamaklara (amonyak (NH3) ve gaz nitrojen (N2) kadar ayrıştırabilmektedir (denitrifikasyon). Olay genellikle anaerobik koşullarda ve redüktase enzimlerinin katalitik etkisiyle sürdürülür.

Test, mikropların türlerini ayırt etmede büyük yardımcı olur. Enterobacteriaceae familyası genellikle pozitif reaksiyon verir. Nitratların ayrışması sonu oluşan ürünler mikropların karakterine göre değişebilir. Her ne kadar gaz nitrojen meydana gelirse de bunun yanı sıra nitrik oksidi (NO) ve nitrös oksid (N2O) veya hidroksilamin (R.NH.OH) de teşekkül edebilir. Bu maddeler hücre içinde metabolize edilerek protein ve nukleik asit yapımında yapıtaşı olarak kullanılırlar.

Materyal

1) İçinde Durham tüpleri bulunan nitratlı (KNO3, % 0.1) sıvı besi yerleri (pH 7.0, 5 ml) gerektiğinde yarı katı besi yeri.
2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (S. gallinarum) ve negatif (H. vaginalis, veya Acinetobacter anitratus) kültürleri.
4) Griess-Ilosvay ayıracı (taze hazırlanmış) (alfa naftilamin % 0.5 (A) + sulfanilik asit %0.8 (B)).
5) Ekilmemiş sıvı besi yerleri.

Metot

Üremiş mikroorganizmalarından nitratlı sıvı besi yerlerine ekim yapıldıktan sonra tüpleri 37°C de 1-5 gün inkubasyona bırakılır. Durham tüpleri içinde gazın oluşumuna dikkat edilir. Tüplere Griess-IIlosvay ayıraçlarından (A+B) 5'er damla konur.

Değerlendirme

1) Tüplerde gaz oluşumu (N2) denitrifikasyonu gösterir ve pozitif olarak kabul edilebilir (eğer bakteriler fermenter değilse). Ancak, böyle tüplere Griess-Illosvay ayıracından A ve B solusyonlarından 5'er damla damlatıldıktan sonra hafifçe çalkalanır. Bir iki dakika içinde kırmızı rengin meydana gelmesi de nitratların nitritlere kadar redükte olduğunu ifade eder (pozitif reaksiyon).
2) Tüplerde gaz yoksa, yine ayıraç damlatılır. Bir iki dakika içinde kırmızı rengin meydana gelmesi pozitif olarak kabul edilir.
3) Eğer, sonuç negatif (hiç reaksiyon oluşmazsa) olarak görülürse, ya nitratlar hiç ayrışmamıştır veya nitratların ayrışması nitrit safhasından da öteye (amonyak veya gaz nitrojene ulaşmış olabilir. Bu durumda, ayıraçlar konmuş olan tüplere çok az miktarda toz çinko (15-20 mg) katılır. Eğer, çinko ilavesi sonu kırmızı renk meydana gelirse (nitrat nitrite redükte olmuştur). Sonuç negatif olarak değerlendirilir. Eğer kırmızı renk oluşmazsa, bu durum, nitratların nitritden de daha öteki safhalara redükte olduğunu ifade eder (pozitif reaksiyon). Amonyak oluşumu de Nessler ayıracı ile ortaya konabilir.

Dikkat edilecek noktalar

1) Bazı mikroorganizmalar fermentasyon sonu tüpler içinde gaz (hidrojen) meydana getirebilir. Bu durum karşısında bakterinin karakterini iyi bilmek gerekir. Eğer tüpte gaz oluşmuşsa ve mikroorganizma fermentasyon oluşturan türden değilse, gazın nitrojen (N2) olma olasılığı büyüktür ve ayıracı koymaya gerek olmayabilir. Ancak, bakteri fermenter türden ise ayıraçları kullanmak zorunludur.
2) Bazı araştırıcılar ayrı katı ortamların daha iyi sonuç verdiğini bildirmektedirler. Gerekirse içinde % 0.02 - 0.04 agar ve % 0.1 KNO3 bulunan yarı katı besiyeri de denenebilir.
3) Ayıraçlar taze hazırlanmaları ve iyi çalıştıkları kontrol edilmelidir. A-reagenti buzdolabında ve buna karşın b-reagenti ise oda sıcaklığında muhafaza edilmelidir.
4) Alfa naftil amin karsinojenik etkiye sahip olduğundan dikkatlice kullanılmalıdır (pamuklu pipetle ve ağızdan çekilerek kullanılmaz).

02.24. Oksidasyon ve/veya Fermentasyon (O/F) Testi

Bu test, mikroorganizmaların karbonhidratları (özellikle, glikozu) ayrıştırmada oksidatif veya fermentatif metabolik yolu kullanma durumlarını saptamada işe yarar ve ayrıca bakterilerin identifikasyonununda da yararlanılır. Bazı mikroorganizmalar glikozu oksidatif karakterde metabolize ederler. Aerobik koşullarda meydana gelen bu reaksiyonda, oksijen, son hidrojen alıcısı olarak görev yapar. Buna karşın, bir kısım bakteriler de, glikozu, oksijenin olmadığı durumlarda ayrıştırma yeteneklerine sahiptirler (fermentasyon). Bu reaksiyon anaerobik şartlarda gelişir ve hidrojen alıcısı olarak oksijenden başka diğer substanslar kullanılır.

Materyal

1) Tüpte hazırlanmış (4-5 ml) dik Hugh ve Leifson besi yerinden 2 (veya gereği kadar) tane
2) Teste tabi tutulacak mikroorganizmaların taze ve saf sıvı kültürleri
3) Kontrol mikroorganizmalar ; oksidasyon için P. aeruginosa ; fermentasyon için E. coli ; negatiflik için Alcaligenes faecalis
4) Steril sıvı parafin

Metot

Taze kültüre batırılmış steril iğne her iki besi yerine dikine daldırılmak suretiyle ekilir. Bir tanesine (fermentasyon için) 1 cm kalınlıkta olacak tarzda sıvı steril parafin ilave edilir. Tüplerin ağzı iyice kapatılır ve 37 °C de 1-15 gün kadar inkübasyonda tutulur ve her gün kontrol edilir.

Değerlendirme

1) Oksidatif karakterde glikozun ayrışması sadece parafinsiz tüpte (açık tüp) görülür. Besiyerinin orijinal rengi (mavi-yeşil) sarıya döner. Bu renk değişimi oksidasyon pozitif olarak değerlendirilir. Üstü kapalı diğer tüpte bir değişiklik yoktur.
2) Fermentatif karakterdeki ayrışmada ise her iki tüpteki besi yerinin rengi sarıya çevrilir.
3) Her iki tüpte renk değişiminin olmaması (sarı rengin meydana gelmemesi) glikozun metabolize olmadığını ifade eder.
4) Değerlendirme kontrollere bakılarak yapılır.

Dikkat edilecek noktalar

1) Bazı araştırıcılar, kullanmadan önce besi yerlerini ısıtarak (su banyosunda), içindeki erimiş havanın çıkmasını sağlarlar. Hemen soğutularak ekim yapılır.
2) Bu besi yeri hareket muayenesi ve gaz teşekkülü için de kullanılabilir.
3) Besi yerleri taze hazırlanmalıdır.
4) Glikoz yanı sıra, diğer karbonhidratlar da denenebilir.
5) Kontrol tüplerde : P. aeruginosa 'da : açık tüpte sarı renk (+), (oksidasyon pozitif) kapalı tüpte mavi renk (-) ; Aerobacter faecalis 'de açık tüpte sarı renk (+), (fermentasyon pozitif) kapalı tüpte sarı renk (+) ; E. coli 'de açık tüpte mavi renk (-), (asit teşekkülü yok) kapalı tüpte mavi renk (-) 'dir.

02.25. Oksidase Testi

Bu test, mikroorganizmalar tarafından sentezlenen ve intrasellüler olan oksidase enziminin (sitokrom C oksidase) varlığını ortaya koymada kullanılır. Deneyden aynı zamanda cinslerin (Moraxella (+), Neisseria (+), Yersinia (-), Acinetobacter (-), ve türlerin (B. ovis (-), B.neotomae (-) ve B. abortus ( + ) ayırımında yararlanılır. Oksidase reaksiyonu, bakterilerde (aerobik olanlarda) sitokrom oksidase sisteminin bulunduğunu ifade eder.

Bu sistem reaksiyonda son hidrojen alıcısı olarak oksijenin kullanımını sağlayarak moleküler oksijeni hidrojen perokside redükte eder. Anaerobik mikroorganizmalarda oksidase sistemi yoktur. Oksidase testi bakterilerde sitokrom C 'nin varlığını ortaya koyar

Yukarıda da görüldüğü gibi (2. basamak) okside olmuş sitokrom C, ayıraçta bulunan p-amino dimetilanilini okside ederek, renkli bileşik oluşturur (kırmızı - mavi renk).

Materyal

1) Petri kutusunda veya tüplerde katı besi yeri (sıvı besi yeri de kullanılabilir).
2) Mikroorganizmanın saf ve taze kültürleri .
3) Kontrol pozitif (P.aeruginosa) ve negatif (E. coli ) suşlarının kültürleri
4)Ayıraç ( %0.5, tetrametil-p-fenilendiamin )

Metot

Mikroorganizmalar katı besi yerine ekildikten sonra 37 °C de 1-5 gün inkubasyona bırakılır. Üremiş koloniler üzerine ayıraç damlatılır.

Değerlendirme

Üzerine ayıraç damlatılan kolonilerin 1-2 dakika içinde kırmızı mavi renk almaları pozitif oksidase testi olarak kabul edilir. Hiç bir renk değişikliğinin olmaması negatif olarak değerlendirilir. Kolonilerin siyah renk alması öldüklerini ifade eder.

Dikkat edilecek noktalar

1) Ayıraç sadece kolonilerin üzerine damlatılır. Bütün plate veya tüpe yayılmaz.
2) Ayıraçlar taze hazırlanmalıdır. Gerektiğinde buzdolabı sıcaklığında muhafaza edilebilirler.
3) Gerektiğinde test filtre kağıt şeritlerinde de yapılabilir. Ayıraca emdirilmiş kağıt şeritler üzerine mikroorganizma kolonileri konur. Kısa bir süre içinde (10-15 saniye ) kırmızı rengin oluşumu pozitif olarak dikkate alınır.
4) Besi yerlerinde glikoz ve nitrat bulunmamalıdır. Triptikase soy agar (TSA), nutrient agar (NA) uygundur.
5) Koloni alınırken platin öze veya cam çubuk kullanılmalıdır.
6) Oksidase ayıracı, serbest oksijen tarafından kolayca okside olur ve duyarlılığını kaybeder. Bunu azaltmak için %0.1 askorbik asit katılabilir.

02.26. Potasyum Siyanid Testi

Bu test, mikroorganizmaların potasyum siyanid (KNC) içeren besi yerlerinde canlı kalma ve üreyebilme durumlarını belirlemek için kullanılır. Aynı zamanda testten, mikroorganizma cins (Citrobacter freundii (+), Salmonella (-), Arizona (-) Klebsiella (-), Enterobacter (+) ve E. coli (-) ve türleri (P. aeruginosa (+) ve Alcaligenes faecalis (-) ayırmada da işe yarar. Siyanid (CN) , bir sitokromoksidase inhibitörüdür. Demir içeren enzimler siyanid tarafından bloke edilirler. Siyanid demirle birleşerek enzimi inaktive eder. Sitokrom oksidase de ağır metalli bir pigment olup (ferro sitokrom oksidase) siyanidle birleşerek elektron transport mekanizmasını sekteye uğratır ve respirasyon durur. Oluşan inhibisyonun derecesi siyanid’in miktarı ile ilgilidir. Bazı mikroplar, ortamda 0.001 M siyanid bulununca üremezler.

Materyal

1) İçinde potasyum siyanid (1/13000 KCN) bulunan sıvı ortam ( pH 7.6 ve 1 ml).
2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (P. aeruginosa veya K. aerogenes) ve negatif (E. coli) suşlarının kültürleri
4) Ekilmemiş tüpler

Metot

Kültürlerden siyanidli brotha ekim yapılır ve 37 °C de 1-3 inkube edilir.

Değerlendirme

Pozitif olgularda tüpte üreme yoktur. Negatif durumlarda üreme meydana gelir. Sonuçlar kontrollerle karşılaştırılarak değerlendirilir.

Dikkat edilecek noktalar

1) KCN çok zehirli olduğu için, bu teste çok gerekli olduğu zaman başvurulmalıdır. KCN solusyonu, pipetle ağız yardımıyla çekilmemelidir. KNC dumanları da teneffüs edilmemelidir. Şırıngadan yararlanılır.
2) Bazal ortamdaki pepton yoğunluğu %0.3 kadar olmalıdır. Yüksek konsantrasyon (%1) şüpheli sonuç verebilir (Salmonella 'larda).
3) KCN 'li besi yeri buzdolabı sıcaklığında 3-4 hafta muhafaza edilebilir.
4) Kültürlerden yapılan inokulasyonlar, bir bulanıklık oluşturmayacak durumda olmalıdır.
5) Siyanidli besi yerleri, içerlerine ferro sulfate ve alkali ilave edildikten sonra otoklava konmalıdırlar.

02.27. Sitrat Testi

Bu test, mikroorganizmaların, besi yerlerine katılan sitratı karbon kaynağı ve amonyum tuzlarını da nitrojen kaynağı olarak kullanabilme yeteneğini saptamada, bakteri cins ve türlerini identifikasyonda kullanılır. Bakteriler tarafından sitratın ayrışması (sitrat metabolizması) enzim sistemi tarafından gerçekleştirilir. Bu enzime citritase (citrate oxalacetate-lyase) veya citrate demolase adı verilir.

Bu enzimin aktivitesi için magnesyum veya manganez tarafından sağlanan divalan katyonlara gereksinim vardır. Sitrat metabolizmasında elde edilen ürünlerin ortamın pH’sı ile sıkı bir ilişkisi vardır. Son ürün ne olursa olsun, sitrat fermentasyonunda esas basamak, piruvat’ın meydana gelişidir. Pirüvatın ayrışma ürünleri besi yerinin pH 'sına bağımlıdır.

Yukarıda da görüldüğü gibi alkali pH da (No.2), daha fazla acetate ve formate meydana gelmesine karşın, asit ortamda (No.3) acetylmethylcarbinol (acetoin) ve lactate’lar esas ününler arasında bulunmaktadır. Sitrat fermentasyonu için kullanılan besi yerlerinde amonyum tuzlarının bulunması nedeniyle de, bakterilerin bu tuzu nitrojen kaynağı olarak kullanabilme yetenekleri de ölçülmektedir. Amonyum tuzu ayrışınca amonyak (NH3) meydana gelerek ortamın pH sı yükselir. Bakteriler tarafından organik asit ve tuzlarının karbon kaynağı olarak kullanılması sonucu karbonatlar ve bikarbonatlar meydana gelir.

Materyal

1) Tüp içinde yatık Simmons citrate agar besi yeri (4-5 ml, pH 6.9 ve yeşil renkte) veya Christensen sitrat sulfid besi yeri (4-5 ml pH 6.7, açık renkte)
2) Test edilecek mikroorganizmaların taze ve saf kültürleri
3) Kontrol pozitif (Klebsiella aerogenes) ve negatif (E. coli) mikroorganizmaları
4) Ekilmemiş besi yerleri

Metot

Muayeneleri yapılacak saf kültürler steril fizyolojik su veya buffer ile biraz sulandırıldıktan sonra besi yerlerine ekimler yapılır ve tüpler 2-7 gün 37 °C inkubasyonda tutulur. Christensen besi yerine iğne ile inokulasyon yapılır ve yatık yüzeye de iğne sürülür.

Değerlendirme

1) Simmons citrate besi yerinde, uygun bir inkubasyon süresi sonunda hiçbir üremenin olmaması ve ortamın orijinal yeşil rengini muhafazası negatif reaksiyon ve ekim hattı boyunca üreme ile birlikte koyu mavi rengin meydana gelmesi de pozitif reaksiyon olarak değerlendirilir.
2) Christensen sitrat sülfid besi yerinde hiç bir renk değişikliğinin görülmemesi (açık rengin muhafaza edilmesi) negatif reaksiyon ve ekim hattı boyunca üreme ile birlikte pembe-kırmızı rengin oluşumu da pozitif reaksiyonu ifade eder.
3) Değerlendirme, kontrollere bakılarak yapılmalıdır.

Dikkat edilecek noktalar

1) Besi yerleri taze hazırlanmalı, buzdolabında muhafaza edilmeli, orijinal rengini kaybedenler teste konulmamalıdır.
2) Besi yerlerine çok fazla ekim yapılmamalıdır. Yanlış pozitif reaksiyon görülebilir. İnokulum uygun oranda sulandırılmalıdır.
3) Besi yerine konan indikatör boyaların (brom timol mavisi ve fenol kırmızısı) ticari firmalara göre değişmek üzere, aynı miktarların da renk farklılıkları görülebilir. Bu yönden dikkatli bulunmak gerekir.
4) Ekim yapılırken pepton, glikozun veya azotun sitratlı besi yerine taşınması, yanlış pozitif reaksiyona yol açabilir.
5) Kullanılan malzeme kimyasal olarak temiz olmalıdır.
6) Simmons sitrat besi yerinde üreyen bir mikroorganizma Christensen’de de üreyebilir. Ancak, Christensen besi yerinde üreyen Simmons ortamında üremeyebilir. Buna göre de pozitiflik değişebilir.

02.28. Ürease Testi

Bu test, mikroorganizmaların üreyi hidrolize eden ürease enzimini saptamak amacıyla yapılır. Ürease hidrolizasyon testi bakterilerin cins ve türlerini tayinde işe yarar. Üre, karbonik asit’in bir diamid’idir. Bütün amidler de kolayca hidrolize olurlar. Ürenin hidrolizasyonu da spesifik bir enzim olan ürease tarafından katalize edilir. Reaksiyonun sonunda 2 molekül amonyak ve karbondioksid meydana gelir.

 

Ürease aktivitesi için optimal pH 7.0 dir. Besiyerinde amonyak meydana gelmesi pH nın yükselmesine neden olur. Amonyağın meydana geldiği de indikatör boya ve Nessler ayıracı ile ortaya konur. Ürease testi için bazı yöntemler (Christensen, Stuart, vs.) geliştirilmiştir. Bunların seçimi araştırıcıya bağlıdır. Aşağıda Christensen Metodu bildirilmiştir.

Materyal

1) Christensen'in üreli agarı (tüp veya petri kutusunda) veya üreli broth
2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol mikroorganizmalar. P. vulgaris (+) ve E. coli (-)

Metot

Petri kutusu üzerine fazla miktarda mikroorganizma ekildikten sonra 37°C de 1-5 gün bırakılır. Her gün kontrol edilen kültürlerde (kırmızı rengin meydana gelmesi pozitif reaksiyon) renk değişmelerine dikkat edilir. Bazı durumlarda renk değişikliği 5-6 saat içinde meydana gelebilir.

Değerlendirme

Kültürde kırmızı rengin meydana gelmesi (amonyak oluşumu nedeniyle pH'nın yükselmesi sonu indikatörün renginin ortaya çıkması) pozitif reaksiyon olarak ve hiçbir değişikliğin olmaması de negatif olarak değerlendirilir.

02.29. Voges - Proskauer (VP) Testi

Bu test, bazı mikroorganizmaların glikozu fermente edilerek, nötral bir ürün olan acetylmethylcarbinol'u (acetoin) meydana getirme yeteneğini tayinde kullanılır. Bakteri türlerini (K. pneumoniae (+), E. coli (-) belirlemede kullanılır. Glikoz, önce pirüvik asit'e metabolize olur. Pirüvik asit, glikolizisde en önemli kilit intermedierdir. Pirüvik asidin ayrışması, bakterilerin türlerine göre aerobik veya anaerobik yolla olur. Glikozun fermentasyonu sonu acetoin ve bunun bir nötral redüksiyon ürünü olan 2,3 -butanediol'da (CH3.CHOH.CH3) meydana gelmektedir.

Voges Proskauer testi ile metil red testi, ortamlarının aynı olması nedeniyle birlikte uygulanabilirler. Metil red pozitif olanlarda (organik asit fazla olması nedeniyle), VP reaksiyonu negatif olabilir. Nötral ürünler meydana gelmeyebilir (genel bir kural değil). İlk başlangıçta MR testi pozitif görülebilir. İnkubasyon süresi uzarsa acetoin oluşabilir.

Materyal

1) MR/VP besi yeri (Clark-Lubs, pH 6.9,5 ml)
2) Mikroorganizmaların saf ve taze kültürleri
3) Kontrol pozitif (E.cloacae, K.pneumoniae) ve negatif (E.coli) suşlarının kültürleri
4) O'Meara ayıracı (veya Barzit VP ayıracı)
5) Ekilmemiş besi yerleri

Metot

İçinde glikoz bulunan bufferlı besi yerine kültürlerden ekilir ve 37°C de 2-7 gün inkube edilir. Bu sürenin sonunda kültürlere ve ekilmemiş tüplere ayıraçtan (O'Meara) 1 ml ilave edilerek hafifçe çalkalanır ve su banyosunda (37°C de) 4 saat tutulur. Aralıklı olarak hafifçe çalkalanır.

Değerlendirme

Besiyerinin üstünde 2-5 dakika içinde pembe rengin oluşu, acetoin varlığını ortaya koyduğundan pozitif reaksiyon olarak kabul edilir. Eğer sarı renk meydana gelirse negatif olarak dikkate alınır.O'Meara testi, ortamda oluşan acetoin'e bağlıdır. Bu madde de, oksijenin bulunduğu durumda alkali ortamda okside olur ve diasetil (CH3.CO.CO.CO3) meydana gelir. Bu son madde de, kreatin'le reaksiyona girerek pembe renk meydana getirir.

Dikkat edilecek noktalar

1) Ayıraçlar kullanılmadan önce iyice kontrol edilmelidirler.
2) Bazen ayıraç ilaveden 1 saat sonra bakır renkli gibi bir görünüm meydana gelebilir. Negatif olarak dikkate alınmalıdır.
3) Et infusyon broth, içinde acetoin ve diasetil bulunabilmesi nedeniyle tercih edilmemelidir.

 

1 Kaynak: Temel Mikrobiyoloji